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穩轉細胞株篩選與構建
閱讀：492 發布時間：2023-12-11穩定細胞株是一種常用于基因表達、藥物篩選和蛋白質表達等領域的工具。但是，穩定細胞株的篩選需要經過一系列的步驟和實驗，下面介紹一下穩定細胞株篩選的兩種方法和穩定細胞株的篩選簡要步驟：
一、質粒轉染法
先把質粒整合到染色體上后，用相應的質粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系，單克隆篩選穩定細胞株。
1、篩選濃度測定，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
2、進行細胞接種，轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80% 覆蓋；
3、進行細胞轉染
4、利用質粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結果。
二、慢病毒轉染法：
應用逆轉錄病毒，慢病毒轉染，篩選穩定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉染得到穩定細胞株的效率高，是建立穩定株的比較不錯的方式。
1、將人源化的抗體基因轉接到慢病毒載體上，
2、使用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
3、用病毒轉染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。
4、后期篩選。轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株。
穩定細胞株篩選步驟：
1.構建攜帶目標基因的載體
首先，需要將目標基因克隆到攜帶有選擇標記的載體中，例如含有抗生素抗性基因的質粒。然后將該載體轉染到目標細胞中。
2.選擇標記篩選
轉染后的細胞需要在含有抗生素的培養基中進行篩選。只有成功轉染的細胞才能夠在含有抗生素的培養基中生長。
3.穩定細胞株的篩選
在完成了選擇標記篩選后，需要對細胞進行進一步的篩選，以得到穩定的細胞株。這可以通過對細胞進行單克隆分離來實現。具體地，將轉染后的細胞在96孔板中進行單克隆分離，每個孔只保留一個細胞。然后，通過檢測細胞株的表達水平和穩定性，篩選出較佳的穩定細胞株。
總結：
穩定細胞株的篩選是一個復雜的過程，需要仔細設計和實驗。通過上述步驟，可以篩選出高表達、穩定的細胞株，為后續的實驗和研究提供了有力的支持。