重組腺病毒在研究和治療應(yīng)用中具有巨大的潛力。  

使用腺病毒將遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)。其允許的宿主細(xì)胞范圍非常廣泛。該病毒已被用于感染許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型（包括增殖性和非增殖性細(xì)胞），以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效表達(dá)。重組腺病毒尤其適用于那些通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞系中的基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達(dá)。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，保持染色體外狀態(tài)（即不整合到宿主染色體中，因此不會(huì)激活或失活宿主基因）。最近，重組腺病毒已被用于將RNAi導(dǎo)入細(xì)胞。  

HEK 293細(xì)胞或其變體被用作病毒擴(kuò)增的宿主細(xì)胞。重組腺病毒可以在高滴度下生長(zhǎng)（101?病毒顆粒/mL，可濃縮至1013病毒顆粒/mL）。濃縮后的病毒上清液通過(guò)CsCl超速離心，將病毒與細(xì)胞蛋白和培養(yǎng)基成分分離。超速離心后，通過(guò)透析去除CsCl。CsCl程序既繁瑣又耗時(shí)（16-24小時(shí)）。  

艾美捷ViraBind腺病毒微量純化試劑盒不涉及超速離心，而是基于腺病毒衣殼蛋白的d特性質(zhì)，通過(guò)離心柱捕獲病毒。整個(gè)過(guò)程大約需要30分鐘。每個(gè)離心柱設(shè)計(jì)用于從一個(gè)T75培養(yǎng)瓶或10厘米培養(yǎng)皿中收獲的病毒進(jìn)行純化，容量可達(dá)1.0×1011病毒顆粒。  

ViraBind 腺病毒小量純化試劑盒提供了一個(gè)高效的系統(tǒng)，用于快速純化腺病毒，回收率超過(guò)95%。

ViraBind腺病毒微量純化試劑盒相關(guān)產(chǎn)品：  

1. AD-100：293AD細(xì)胞系  

2. AD-200：ViraDuctin 腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑，10次轉(zhuǎn)導(dǎo)  

3. VPK-109：QuickTiter 腺病毒滴度免疫測(cè)定試劑盒  

4. VPK-111：快速RCA測(cè)定試劑盒  

5. VPK-252：RAPAd® CMV腺病毒表達(dá)系統(tǒng)    

ViraBind腺病毒微量純化試劑盒（#VPK-099）組成：  

1. ViraBind 離心柱和收集管（部件編號(hào)40991）：10個(gè)迷你離心柱和20個(gè)收集管的包裝。  

2. 上樣緩沖液（部件編號(hào)40992）：一瓶10 mL。  

3. 洗滌緩沖液（部件編號(hào)40993）：一瓶20 mL。  

4. 洗脫緩沖液（部件編號(hào)40994）：一瓶10 mL，含25 mM Tris，pH 7.5，2.5 mM MgCl?，1 M NaCl。    

未提供材料：  

1. 感興趣的重組腺病毒  

2. HEK 293細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基  

3. 細(xì)胞培養(yǎng)離心機(jī)  

4. 甘油  

5. 微量離心機(jī)  

儲(chǔ)存：將所有試劑盒組分儲(chǔ)存于室溫。

安全注意事項(xiàng)：請(qǐng)記住，您將處理含有感染性病毒的樣本。請(qǐng)遵循NIH推薦的針對(duì)BSL-2生物體的所有材料的指南。

感染細(xì)胞裂解液的收獲：  

以下程序適用于T75培養(yǎng)瓶，可根據(jù)個(gè)人需求進(jìn)行優(yōu)化。  

1. 使用HEK 293細(xì)胞，這些細(xì)胞應(yīng)在感染前定期傳代2-3次。將這些細(xì)胞培養(yǎng)至單層細(xì)胞達(dá)到90-100%匯合。  

2. 用新的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)基，每瓶15 mL。然后將腺病毒加入培養(yǎng)物中。可以使用粗制或純化的病毒庫(kù)存。每細(xì)胞期望的感染復(fù)數(shù)（PFU，噬菌斑形成單位）為0.5到2。  

3. 24小時(shí)后，部分細(xì)胞應(yīng)處于懸浮狀態(tài)。向培養(yǎng)瓶中加入10 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并讓病毒再擴(kuò)增24小時(shí)。當(dāng)所有細(xì)胞都處于懸浮狀態(tài)時(shí)，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶數(shù)次，并將所有培養(yǎng)基（包括細(xì)胞）收獲到無(wú)菌管中。  

4. 以1000 rpm離心5分鐘，沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于0.8 mL培養(yǎng)基中，并通過(guò)三次凍融循環(huán)從細(xì)胞中釋放腺病毒。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量離心管中，并丟棄細(xì)胞碎片。  

5. 以10,000 rpm離心10分鐘，進(jìn)一步沉淀任何剩余的細(xì)胞碎片。丟棄沉淀，保存上清液。如果仍可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，再次離心上清液。  

注意：此步驟有助于防止在病毒純化步驟中離心柱堵塞。  

6. 病毒上清液可在-80°C下保存，或立即進(jìn)行純化（見(jiàn)以下純化說(shuō)明）。   

結(jié)果示例：  

以下圖表展示了典型的純化結(jié)果。以下數(shù)據(jù)僅供參考，不應(yīng)用于解釋實(shí)際結(jié)果。

圖上：重組Ad-β Gal的純化。根據(jù)純化說(shuō)明純化重組Ad-β Gal病毒。在純化過(guò)程中獲得的每個(gè)組分及其稀釋液用于感染12孔板中的A549細(xì)胞。48小時(shí)后，進(jìn)行X-gal染色，并對(duì)β Gal陽(yáng)性細(xì)胞（藍(lán)色）進(jìn)行計(jì)分。

圖下：由激活的H-Ras誘導(dǎo)的膜褶皺。COS-7細(xì)胞以50 MOI（感染復(fù)數(shù)）的感染量被純化的Ad-β Gal或Ras G12V感染。感染48小時(shí)后進(jìn)行X-gal染色。通過(guò)用羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽染色肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，可視化膜褶皺。

ViraBind腺病毒微量純化試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Stewart, P. L., Fuller, S. D., and Burnett, R. M. (1993) EMBO J. 12, 2589-2599.

2. Robbins, P. D., Tahara, H., and Ghivizzani, S. C. (1998) Trends Biotechnol. 16, 35-40.

3. Huang, S., Stupack, D., Mathias, P., Wang, Y., and Nemerow, G. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 94, 8156-8161.

4. Bergelson, J. M., J. A. Cunningham, G. Droguett, E. A. Kurt-Jones, A. Krithivas, J. S. Hong, M. S.

Horwitz, R. L. Crowell, and R. W. Finberg. (1997) Science 275:1320-1323.

5. Von Seggern, D. J., C. Y. Chiu, S. K. Fleck, P. L. Stewart, and G. R. Nemerow. (1999) J. Virol.

73:1601-1608.

6. Kleinerman, D. I., W. W. Zhang, S. H. Lin, N. T. Van, A. C. von Eschenbach, and J. T. Hsieh.

(1995) Cancer Res. 55:2831-2836.