人拓撲異構(gòu)酶II檢測試劑盒旨在檢測任何II型拓撲異異構(gòu)酶，無論是真核還是原核。具體來說，我們的Top2測定有助于II型酶的純化和表征，并含有II型拓撲異構(gòu)酶常規(guī)測定所需的所有試劑。該測定基于動基質(zhì)DNA（kDNA）的脫觸手，由于它對II型活性（不是I型）具有特異性，因此可以用粗細胞提取物進行。使用TopoGEN開發(fā)的新型凝膠系統(tǒng)分解反應(yīng)產(chǎn)物，該系統(tǒng)可以極其快速和明確地檢測拓撲異構(gòu)酶II的活性。包括適當(dāng)?shù)木彌_液、DNA底物和DNA標記。Human Top2a包含在目錄號中用-A表示的試劑盒中。包括拓撲異構(gòu)酶II脫乙酰化和線性DNA標記，以便清楚、容易地鑒定用戶定義的提取物或組分中的拓撲異酶II活性。該檢測試劑盒還可以與純化的酶（由TopoGEN提供）結(jié)合使用，以檢測topo II的抑制劑。kDNA測定將檢測刺激拓撲異構(gòu)酶II切割DNA的毒物以及簡單抑制催化活性的試劑。基于kDNA的測定的優(yōu)點是，該測定快速且容易，可以從粗混合物或提取物中以活性為導(dǎo)向純化抑制劑。

TopoGEN 拓撲異構(gòu)酶II檢測試劑盒旨在快速、特異地檢測任何II型拓撲異構(gòu)酶，無論是真核還是原核。該試劑盒有助于II型酶的純化和表征，并含有拓撲異構(gòu)酶II常規(guī)檢測所需的所有試劑。

艾美捷TopoGEN拓撲異構(gòu)酶II檢測試劑盒（20微克kDNA）：

編號：TG1001

分類：拓撲試劑盒

標簽：人類拓撲異構(gòu)酶2，top2a，拓撲異構(gòu)酶2，拓撲異構(gòu)酶2測定，拓撲異構(gòu)酶2測定試劑盒

該試劑盒在環(huán)境溫度下運輸，如果與酶一起購買，則在干冰上運輸。將酶儲存在-70°C。DNA應(yīng)儲存在4°C。收到分析緩沖液成分后，應(yīng)儲存在-20°C。

人類拓撲異構(gòu)酶II測定試劑盒內(nèi)容（適用于100次測定試劑盒規(guī)格）

100單位人類Top2a酶（可使用目錄編號TG1001-1A獲取）

20微克的Kinetoplast DNA (kDNA)

線性kDNA標記在凝膠加載緩沖液中

解鏈kDNA標記（經(jīng)拓撲異構(gòu)酶II處理）

10倍拓撲異構(gòu)酶II測定緩沖液*

5倍停止緩沖液/凝膠加載染料

詳細說明書

*為了提高穩(wěn)定性，10倍拓撲異構(gòu)酶II測定緩沖液提供為兩個組分：緩沖液A（不含ATP）和緩沖液B（含ATP）。每次通過混合緩沖液A和B新鮮配制完整的10倍測定緩沖液。

使用人類拓撲異構(gòu)酶II測定試劑盒進行拓撲異構(gòu)酶II活性滴定：

人類拓撲異構(gòu)酶II測定

第1道：200納克線性化kDNA

第2道：200納克解鏈kDNA

第3道：無拓撲異構(gòu)酶II

第4道：1:2稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

第5道：1:4稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

第6道：1:8稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

第7道：1:16稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

第8道：1:32稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

第9道：1:64稀釋的拓撲異構(gòu)酶II

人類拓撲異構(gòu)酶II酶與kDNA在37°C下孵育15分鐘，使用試劑盒提供的測定緩沖液。酶濃度大約為每微升2單位。反應(yīng)用停止緩沖液終止，并直接加載到含有乙酰胺（0.5微克/毫升）的1%瓊脂糖凝膠上。電泳后，凝膠脫色30分鐘并拍照。請注意，解鏈產(chǎn)物包含開放環(huán)（上帶）和共價閉合環(huán)（松弛）小環(huán)DNA。還要注意，線性DNA在斷裂和松弛物種之間遷移。所有kDNA制備中都存在斷裂的小環(huán)DNA。此外，不同kDNA制備中斷裂DNA的數(shù)量可能有所不同。試劑盒中提供線性和解鏈kDNA標記。運行這些標記以識別不同形態(tài)的位置非常重要。當(dāng)測定粗提物時，還需要注意提取物通常可能含有紫外線熒光污染物（例如RNA或DNA分解產(chǎn)物）。這些標記將有助于識別此類偽影；然而，我們也建議您運行一條不含kDNA底物的蛋白提取物，以揭示這些污染物。

并發(fā)癥：

最嚴重的并發(fā)癥出現(xiàn)在被測定的提取物中存在干擾蛋白或物質(zhì)時。粗提物、無細胞提取物可能含有過量的DNA結(jié)合蛋白或正電荷蛋白，它們粘附在DNA上并抑制酶的接觸。此外，核酸酶污染物可能會降解或切割kDNA底物，因此模糊結(jié)果。處理這個問題的一個好方法包括通過硫酸銨沉淀和柱層析來清理粗提物。此外，通過稀釋提取物和/或添加tRNA載體（以競爭基本蛋白），有時可以最小化此類問題。

TopoGEN拓撲異構(gòu)酶II檢測試劑盒文獻參考：

Huimin Zhang, Yun Xiong, Yilun Sun, Jeong-Min Park, Dan Su, Xu Feng, Sarah Keast, Mengfan Tang, Min Huang, Chao Wang, Mrinal Srivastava, Chang Yang, Dandan Zhu, Zhen Chen, Siting Li, Ling Yin, Yves Pommier, Junjie Chen: RAD54L2-mediated DNA damage avoidance pathway specifically preserves genome integrity in response to topoisomerase 2 poisons. Science Advances 9 (49), eadi6681.

Aruna S Jaiswal, Arijit Dutta, Gayathri Srinivasan, Yaxia Yuan, Daohong Zhou, Montaser Shaheen, Doraid T Sadideen, Austin Kirby, Elizabeth A Williamson, Yogesh K Gupta, Shaun K Olsen, Mingjiang Xu, Eva Loranc, Pramiti Mukhopadhyay, Alexander Pertsemlidis, Alexander J R Bishop, Patrick Sung, Jac A Nickoloff, Robert Hromas: TATDN2 resolution of R-loops is required for survival of BRCA1-mutant cancer cells. Nucleic Acids Research, gkad952,

Gardner L, Malik R, Shimizu Y, Mullins N, Elshamy WM: Geminin overexpression prevents the completion of topoisomerase IIα chromosome decatenation, leading to aneuploidy in human mammary epithelial cells.  Breast Cancer Research 2011, 13(3): R53.  doi: 10.1186/bcr2884

Bower J, Karaca GF, Zhou Y, Simpson DA, Cordeiro-Stone M, Kaufman WK: Topoisomerase IIa maintains genomic stability through decatenation G2 checkpoint signaling.  Oncogene 2010, 29(34): 4787-4799.  doi: 10.1038/onc.2010.232

Polycarpou-Schwarz M, Müller K, Denger S, Riddell A, Lewis J, Gannon F, Reid G: Thanatop: A Novel 5-Nitrofuran that is a highly active, cell-permeable inhibitor of topoisomerase II.  Cancer Research 2007, 67: 4451-4458.  doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-0393

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