活性氧自由基（ROS）是氧氣正常代謝的自然產物，對細胞信號傳導和穩態調節起著重要作用。在與氧化應激相關的條件下，ROS水平會顯著增加。ROS的積累可能嚴重損傷細胞結構。氧化應激在心血管疾病、糖尿病、骨質疏松癥、中風、炎癥性疾病、神經退行性疾病和癌癥等研究中起著重要作用。ROS檢測可幫助確定氧化應激如何調節各種細胞內途徑。EZMeta™活性氧自由基（ROS）檢測熒光試劑盒提供了一種簡單、敏感、快速的ROS檢測方法。其原理基于熒光探針DCFH-DA。DCFH-DA是一種細胞滲透敏感的探針，用于檢測細胞內活性氧自由基（ROS）。該探針在通過活細胞膜時會被細胞內酯酶水解為DCFH。DCFH無熒光并且不能穿透細胞膜，但可以被細胞內ROS氧化并產生熒光的DCF。然后，通過流式細胞術或熒光顯微鏡檢測熒光信號，可以分析細胞內活性氧自由基的水平。

艾美捷Biogradetech活性氧 (ROS) 含量檢測試劑盒：

貨號：D-AKC1910

規格：50T / 100T

儲存：儲存于-20°C，避光，保存12個月

適用樣本：細胞

提供的材料和儲存條件：

分析程訊：

對于刺激時間較短的細胞（通常少于2小時），建議先加載探針，然后用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細胞；對于需要長時間刺激的細胞（通常超過6小時），建議在加載探針之前用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細胞，這里只提供后一種實驗方法，步驟如下：

1. 原位加載探針（僅適用于附著細胞）

a) 細胞準備：在測試前一天放置細胞板，確保細胞數目小于5×10^5/mL。

b) 藥物誘導：去除細胞培養基，加入無血清稀釋藥物處理細胞，在黑暗中在37°C細胞培養箱中孵育。實際誘導時間取決于藥物特性和細胞類型。

c) （可選）陽性對照：用無血清培養基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細胞在黑暗中孵育37°C，時間為30分鐘至4小時。為了提高活性氧自由基的水平，不同細胞類型的實際時間不同。例如，HeLa細胞需要處理30-60分鐘。注意：陽性對照僅在陽性對照孔中需要，其他實驗組不需要。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 加載活性氧自由基探針：去除處理藥物，用無血清培養基洗滌細胞1-2次，加入適量稀釋的DCFH-DA工作溶液，細胞需要完-全覆蓋，例如6孔板通常添加不少于1 mL/孔，96孔板通常添加不少于100 μL/孔。細胞在37°C培養箱中黑暗中孵育30分鐘。

f) 清洗細胞：細胞用無血清培養基洗滌1-2次，去除未進入細胞的DCFH-DA。

2. 收集細胞并加載探針（適用于附著細胞和懸浮細胞）

a) 細胞準備：按照標準方法培養細胞。需要確保用于測試的細胞狀態良好。根據適當的方法清潔并收集足夠數量的細胞。

b) 藥物誘導：收集的細胞懸浮在適量的稀釋藥物中，在37°C培養箱中黑暗中孵育。實際誘導時間可以根據藥物特性和細胞類型確定。

c) （可選）陽性對照：用無血清培養基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細胞在黑暗中孵育37°C，時間為30分鐘至4小時。為了提高活性氧自由基的水平，不同細胞類型的實際時間不同。例如，HeLa細胞需要處理30-60分鐘。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 探針加載：離心收集細胞，去除處理藥物，用無血清培養基洗滌細胞1-2次，再次離心收集細胞，加入稀釋的探針，使細胞密度為1.0×10^6-2.0×10^7。細胞在37°C培養箱中黑暗中孵育30分鐘。注意：細胞密度應根據后續的檢測系統、檢測方法和總檢測量進行調整。例如，對于流式細胞術，單管中的細胞數目不應少于10^4且不超過10^6。

f) 清洗細胞：用無血清培養基洗滌細胞1-2次，去除未進入細胞的DCFH-DA。

3.熒光顯微鏡照片

a) 附著細胞（步驟1.f）可以直接在熒光顯微鏡下觀察；對于懸浮細胞（步驟2.f），將25-50 μL細胞懸浮液滴在顯微鏡載玻片上，用蓋玻片覆蓋進行觀察。

b) 在熒光顯微鏡下，使用FITC濾光片觀察熒光，并去除背景以觀察熒光變化。

4. 流式細胞術的操作和分析方法

a) 附著細胞（步驟1.f）用胰蛋白酶消化制備單細胞懸浮液；對于懸浮細胞（步驟2.f），直接收集細胞。細胞用0.5-1 mL PBS（0.5-1×10^5/mL）重新懸浮。

b) 在流式細胞術中，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。可以實時或定時檢測刺激前后熒光強度的變化。

該試劑僅用于科學研究領域，不適用于臨床診斷或其他用途。