酶聯免疫斑點實驗 (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一種在96孔板內的一百萬個細胞中實現對單個分泌細胞進行定量檢測的新型的免疫酶技術。靈敏度高，易操作，成本相對流式細胞術較低，已被廣泛應用于癌癥研究，疾病探索以及疫苗研發等領域。

ELISpot原理：將細胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養，在有刺激的條件下，細胞分泌的細胞因子或免疫球蛋白會被包被抗體捕獲。移除細胞后，被捕獲的細胞因子可進一步使用生物素標記的二抗來標識，其后再與酶標記的親和素作用，并加入底物使其呈色，有反應作用的細胞會留下直徑大小不等的染色斑點。

常見疑難問題解答：

1.推薦哪種ELISpot板子？

建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效結合大量捕獲抗體，前提是膜用乙醇預處理（即活化）。

2.板的顏色是否重要，我應選擇白色板子還是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同，但并不重要。（如果有沒有添加液體的漏掉的孔，透明的板子很容易看見。）

3.包被前為什么要用乙醇對ELISpot板進行預處理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水結構。為了使大量捕獲抗體能夠結合，應該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質量斑點所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預包被和EtOH處理的protocol。

4.冷凍細胞可以用于ELISpot嗎？

冷凍保存的細胞非常適合ELISpot。然而，其結果取決于細胞的質量，必須建立冷凍/解凍的程序以產生具有高活力的細胞。標準冷凍程序應包括使用DMSO和胎牛血清或類似物，并逐步冷凍程序。

5.在ELISpot中每孔使用多少個細胞？

必須將每個孔中的細胞數量調整為細胞類型和分泌細胞的預期頻率。如果頻率非常低，例如10,000個細胞中的1個，則需要更多數量的細胞，通常約250,000個細胞/孔。當分泌細胞的頻率高時，例如10個細胞中的1個，約5,000個細胞/孔就足夠了。細胞數量在測定中并不總是顯示線性，因為需要細胞-細胞的zui佳接觸，例如抗原呈遞細胞的充分刺激。當分析抗原特異性T細胞時，PBMC不應低于每孔200,000個細胞。

通常不建議使用超過500,000個細胞/孔，因為這可能產生多個細胞層，反過來由于細胞和ELISpot膜之間的距離增加而導致斑點質量降低。

6.可以在ELISpot中使用人血清嗎？

由于以下原因，不建議在ELISpot中使用人血清。當分析人類樣品時，感興趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）實際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測抗體結合，因此會導致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體，其可與來自許多物種的Ig交叉反應。這種反應可能會導致雙抗夾心免疫檢測中抗體交聯的問題。在ELISpot中，它將導致膜的普遍變暗。

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