亚洲中文字幕久久无码精品,日韩中文高清在线,国产精品爽爽久久久久久

產(chǎn)品分類 品牌分類

圓派新聞|Leica 冷凍電鏡技術(shù)未來之路在何方?

閱讀：1079 發(fā)布時間：2017-12-7

新聞 | 凍電鏡技術(shù)未來之路在何方?

文章來源：
時間：2017-12-06 10:54

2017年諾貝爾化學獎授予了理查德·亨德森（Richard Henderson）、約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和雅克·杜博歇（Jacques Dubochet），表彰他們在冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展上做出的貢獻。

他們將冷凍電鏡技術(shù)簡化，并將其應用在生物分子成像方向，打破了長期以來解析蛋白必須依靠傳統(tǒng)X射線晶體學（X-raycrystallography），核磁共振(NMR)的手段，使我們在近期內(nèi)很有可能獲得原子級別分辨率下的生命復雜機制的詳細圖像。（圖片來源：Martin Hogbom）

其中，尤其值得一提的是杜博歇教授的工作: 他將少量蛋白溶液滴加到銅網(wǎng)上，迅速插入到用液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，使蛋白顆粒迅速被制冷的玻璃態(tài)的冰所包裹，zui大程度上保存了蛋白顆粒的真實原始狀態(tài)，得到了高質(zhì)量的冷凍電鏡樣品，從而大大推動了冷凍電鏡的推廣。

既然冷凍樣品制備如此重要，有沒有儀器可以提高我們實驗的重復性和成功率呢？

有！那就是我們徠卡的載網(wǎng)投入冷凍儀GP。Leica EM GP設(shè)計用于冷凍電鏡樣品前處理，用于制備玻璃化的液態(tài)樣品。如病毒顆粒，蛋白質(zhì)及其他細胞組分等的樣品懸液。

冷凍電鏡技術(shù)未來之路在何方?
Celluar CryoEM

除了蛋白等生物大分子外，生物樣品還有很重要的一面是細胞和組織。即使目前很多重要的蛋白結(jié)構(gòu)都得到了埃米級別的解析，但由于它們都是純化出來的，已經(jīng)脫離了原來位置，如同一片樹葉脫離了大樹，研究的再深刻，目前也只是一葉遮目，不要說推測這片樹葉在森林里的位置，即使在哪顆特定大樹上的生長部位和結(jié)構(gòu)都很難說。因此解析細胞或組織這樣大尺度的高分辨精細結(jié)構(gòu)具有更廣泛的生物學意義。

那我們對于它們的制樣手段研究進展如何？

這又不得不提這次諾獎的杜博歇教授。他不僅建立了單顆粒冷凍制樣技術(shù)，同時也在細胞組織層面做出了突出的貢獻，尤其是CEMOVIS(Cryo-Electron Microscopy Of VItreous Sections)的發(fā)展和逐漸完善，實現(xiàn)了近生理狀態(tài)的細胞組織的原位觀察。CEMOVIS沒有化學固定，沒有染色，也沒有生物成分的聚集；保持了生物體內(nèi)水分的原位，玻璃態(tài)的固定。應用CEMOVIS得到的電鏡圖片看起來和常規(guī)制樣圖片有很大不同：結(jié)構(gòu)更平滑均質(zhì)，細節(jié)更多更明顯。那么它的技術(shù)路線是什么呢？高壓冷凍+冷凍切片+冷凍電鏡。杜博歇教授初期的工作就有用徠卡的EM PACT（徠卡*代高壓冷凍儀）對樣品進行冷凍，用FCS Ultracut S cryomicrotome（徠卡早期冷凍切片機）進行冷凍切片，zui后在冷凍透射電鏡下觀察（見下圖）。

作為高壓冷凍領(lǐng)域的，徠卡迄今已經(jīng)發(fā)展到第三代高壓冷凍儀-ICE(Innovative Cryo-fixation Equipment)。高壓冷凍儀是通過液氮制冷，通過空氣壓縮機提供壓力來源，通過物理原理可使局部壓強達到2100拔，從而實現(xiàn)對含水樣本的高壓冷凍固定, 冷凍固定后樣品經(jīng)后續(xù)處理（冷凍替代/常溫超薄切片，冷凍超薄切片或冷凍斷裂等）供電子顯微鏡觀測。

高壓冷凍儀能在毫秒級別內(nèi)zui大程度地保存樣品生活狀態(tài)的原始真實信息，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶/抗原活性無變化，可溶性離子及小分子得到有效固定等等，有效避免了常規(guī)化學固定帶來的假象。

除了可以結(jié)合冷凍切片，完成CEMOVIS的工作外，它還可以結(jié)合冷凍斷裂，冷凍替代等來觀察樣品的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)或進行免疫學的相關(guān)工作。除此之外，它還可以結(jié)合光刺激和電刺激，為神經(jīng)生理學家打開了一扇新的大門。

現(xiàn)在，冷凍制樣逐漸深入人心，那冷凍好的樣品，經(jīng)過處理，能否在光鏡下同時實現(xiàn)其功能的探究呢？
徠卡EM Cryo CLEM（Cryo Correlative Light Electron Microscopy）冷凍光鏡電鏡聯(lián)用系統(tǒng)，實現(xiàn)保持樣品原生狀態(tài)下的光鏡和電鏡d圖像關(guān)聯(lián)分析，對同一樣品位置集熒光顯微圖像與高分辨率電鏡圖像于一體。

它的主要技術(shù)路線是：通過冷凍制樣技術(shù)（高壓冷凍，保存樣品zui原始的亞細胞結(jié)構(gòu)信息），制備得到冷凍超薄切片（或通過投入冷凍技術(shù)冷凍樣品），之后借助冷凍光鏡觀察熒光標記位置，記錄感興趣的位置，然后在冷凍TEM中實現(xiàn)原位電鏡觀察，從而實現(xiàn)光鏡電鏡聯(lián)用技術(shù)。