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經典回顧：NMT發現神經元線粒體耗O2速率增加為Bcl2家族改善神經元
NMT作為生命科學底層核心技術，是建立活體創新科研平臺的*技術。2005年~2020年，NMT已扎根中國15年。2020年，中國NMT銷往瑞士蘇黎世大學，正式打開歐洲市場。
基本信息
主題：NMT發現神經元線粒體耗O2速率增加為Bcl2家族改善神經元代謝提供直接證據
期刊：Nature cell biology
影響因子：20.042
研究使用平臺：NMT神經研究創新平臺
標題：Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1F0 ATP synthase
作者：耶魯大學Elizabeth A. Jonas、Kambiz N. Alavian
檢測離子/分子指標
O2
檢測樣品
大鼠海馬神經元
中文摘要（谷歌機翻）
離子/分子流實驗處理
① GFP-Bcl-xL表達神經元與mito-GFP表達神經元CSCW2-熒光素酶慢病毒轉染7 d
② 單個不表達神經元或表達Bcl-xL shRNA或混亂shRNA的神經元CSCW2-熒光素酶慢病毒轉染7 d
③ 單個神經元10 μM ABT-737處理18 h
④ 90 mM KCl和5 mg ml-1寡霉素處理表達Bcl-xL-GFP或mito-GFP的單個神經元
⑤ 螢火蟲熒光素酶在有無1 μM ABT-737處理海馬神經元中的發光5 min，隨后用90 mM KCl處理90 s。
先前的工作描述了過表達Bcl-xL的神經元中線粒體生物量的增加。如果線粒體生物量的增加是造成ATP水平升高的原因，那么表達Bcl-xL的細胞有望增加攝氧量。為了驗證這一點，使用O2流速微傳感器檢測單個神經元的氧攝取量。與預期相反，過表達Bcl-xL的神經元的O2流速低于轉染mito-GFP的神經元（圖1b），這表明過表達Bcl-xL的神經元更有效地將ATP的產生與O2的吸收結合。內源性Bcl-xL具有類似的作用，因為shRNA介導的消耗（圖1c, d）或Bcl-xL活性的藥理抑制作用（圖1e）增加了神經元的O2流速。這些數據表明，Bcl-xL的消耗或抑制使ATP的產生與O2的攝取解偶聯。
從理論上講，較高的ATP水平和過表達Bcl-xL的神經元的O2攝取水平較低，可能是由于電活動和突觸活動水平降低而導致ATP積累的靜止狀態。這不太可能，是因為Bcl-xL過表達的神經元具有比對照更大的突觸和更多的自發活動。
因此，作者研究了過表達Bcl-xL的神經元是否具有更大但未被充分利用的能量。當細胞在高鉀條件下去極化時，Bcl-xL過表達的神經元O2流速比基礎水平增加了約90%，這是一種已知的刺激神經元電活動和突觸活動的處理方法（圖1f），而mito-GFP表達對照則僅增加了50%。
在氧化磷酸化過程中，從線粒體基質中泵出的質子通過ATP合成酶處的線粒體內膜的H+流速（生產流速）和H+外排（非生產性）重新進入基質。減少非生產性外排可提高ATP生產效率。為了確定Bcl-xL過表達的神經元在大活性期間是否有不同程度的非生產性穿過內膜的外排，高鉀被迅速沖洗出去，并在寡霉素中測量O2攝取量，寡霉素抑制與ATP生成相關的H+流速，但不抑制與非生產性外排相關的H+流速。與mito-GFP表達對照相比，GFP-Bcl-xL細胞具有更高的產O2流速與總O2流速的比值，表明它們利用更高的整體峰值O2流速百分比來制造ATP（圖1g）。
圖1. Bcl-xL改變神經元對O2的吸收
其他實驗結果
Bcl-xL過表達的神經元ATP水平升高，Bcl-xL缺失的神經元ATP水平降低。
Bcl-xL是刺激引起的代謝變化所必需的。
Bcl-xL定位于線粒體內膜。
重組Bcl-xL蛋白增強了F1F0 ATPase的酶促速率。 在F1F0 ATPase活動期間，Bcl-xL抑制減弱H+進入亞線粒體囊泡。 內源性Bcl-xL是ATP結合后抑制膜泄漏所必需的。
Bcl-xL增加線粒體ATP的產生，可使細胞在缺乏Bax或Bak的情況下免受代謝損害。
結論
本研究發現過表達Bcl-xL的神經元具有較高的ATP水平，而內源性Bcl-xL被消耗或抑制的細胞具有較低的ATP水平。盡管ATP水平升高，但過表達Bcl-xL的神經元耗氧量較少，Bcl-xL消耗增加了氧攝取水平。除其外膜定位外，研究通過免疫電鏡在線粒體基質中發現Bcl-xL。Bcl-xL與F1F0 ATP合酶的β亞基免疫共沉淀，與純化的F1 ATP合酶重組β亞基結合。外源施加Bcl-xL使F1F0 ATPase活性水平升高，Bcl-xL抑制使酶促速率降低。Bcl-xL缺失使含F1F0-ATPase的遞質線粒體囊泡對H+離子的隔離能力下降，表明Bcl-xL消耗引起質子在激活該酶后外排。通過膜片鉗檢測暴露于ATP的含F1F0-ATPase的囊泡，記錄到Bcl-xL被抑制或耗盡時外滲電導增加。因此，本研究提出了一個模型，其中Bcl-xL通過減少F1F0 ATPase中的質子外排來提高ATP合成的效率，從而改善神經元的新陳代謝。
測試液
90 mM KCl, 64 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.4
關鍵詞：能量代謝、神經元、線粒體、F1F0、ATP