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基本信息

主題：NMT檢測抗癌藥對活體斑馬魚泌酸及神經丘生理功能影響評價其環境毒性

期刊：Aquatic Toxicology

影響因子：4.346

研究使用平臺：NMT斑馬魚科創新平臺

標題：Vincristine exposure impairs skin keratinocytes, ionocytes, and lateral-line hair cells in developing zebrafish embryos

作者：中國臺灣師范大學林豊益、Giun-Yi Hung

檢測離子/分子指標

Ca²⁺、H⁺（pH）

檢測樣品

H⁺（pH）：斑馬魚胚胎皮膚離子細胞

Ca²⁺：斑馬魚胚胎L1神經丘（側線毛細胞）

離子/分子流實驗處理

斑馬魚在0、1、10、15或25 mg/L的長春新堿（vincristine，VCR）中孵育96 h

將H⁺流速微傳感器放置在斑馬魚胚胎皮膚離子細胞表面以檢測[H⁺]梯度變化（圖1D）。測得的[H⁺]梯度變化代表胚胎皮膚分泌酸的情況。用不同濃度的VCR（0、1、10、15和25 mg/L）孵育受精后96 h（96 hfp）的斑馬魚，[H⁺]梯度在用10、15和25 mg/L VCR孵育的胚胎中逐漸降低（圖1E）。

圖1. 長春新堿對96 hfp斑馬魚胚胎酸分泌的影響

通過非損傷微測技術（NMT）檢測胚胎L1神經丘的Ca²⁺內流速率（圖2A）。圖2B顯示，與對照組相比，1 mg/L組的Ca²⁺內流速率減少了>20%（P <0.05）。Ca²⁺內流速率隨著VCR濃度的增加呈劑量依賴性遞減趨勢，10 mg/L組的Ca²⁺內流速率減少了>60%（P<0.001），15 mg/L組的Ca²⁺內流速率幾乎檢測不到（P<0.001）。25 mg/L組的神經丘幾乎*消失，所以沒有對該組進行測定。

圖2. 長春新堿對斑馬魚毛細胞Ca²⁺內流的影響

其他實驗結果

• 在用VCR處理斑馬魚0~96 h期間的半致死濃度（LC₅₀）約為20.6 mg/L。

• 在VCR暴露96 h后，≥10 mg/L時，斑馬魚胚胎的心率（每分鐘）以濃度依賴的方式顯著降低。

• 隨著VCR濃度的升高，發現其有明顯的致畸作用，表現為進行性生長遲緩、眼部尺寸縮小、S形脊柱彎曲、尾端扭曲、卵黃囊水腫、心包腔增大。

• 15和25 mg/L VCR孵育后斑馬魚胚胎體內Ca²⁺和K⁺含量顯著降低；10、15、25 mg/L VCR孵育后Na⁺含量顯著降低。

• 10、15、25 mg/L VCR處理的胚胎HR（H⁺-ATPase rich）細胞數明顯減少。15和25 mg/L VCR處理的胚胎NaR（Na⁺/K⁺-ATPase-rich）細胞數量明顯減少。

• 用掃描電鏡觀察胚胎皮膚角質細胞的形態。對照組角質細胞為多角形上皮細胞，膜上有“指紋”（微嵴）結構。10 mg/L組角質細胞的微嵴變得不完整，在15和25 mg/L VCR處理時被嚴重破壞或已消失。

• 用掃描電鏡觀察不同濃度VCR孵育L1神經丘毛束形態。10、15和25 mg/L VCR處理的胚胎毛束形態呈漸進性變粗。10、15、25 mg/L組L1神經丘頂端面積有所下降。

• 隨著VCR濃度增加L1神經丘毛細胞數量逐漸減少至幾乎*消失。

總之，VCR表現出致畸性，并可以誘導斑馬魚胚胎皮膚離子細胞功能損傷。為了證明VCR誘導的急性胚胎毒性，本研究引入了一種非經典的測量體軸畸形的方法，通過說明BL1、BL2以及BL1/BL2的比例，以更好地量化C型或S型的體軸曲率。在低至1 mg/L的VCR條件下，NMT可檢測到體內側線毛細胞的功能性損傷。當VCR≥10 mg/L時，對皮膚離子細胞和角質細胞的損傷可導致離子穩態失調、心包水腫和胚胎發育障礙。所有這些功能和形態變化都是在LC₅₀水平以下發生的。使用掃描電鏡能夠可視化表皮VCR相關損傷的過程，并可能在皮膚損傷后重新上皮化。此外，NMT是檢測上皮細胞包括側線毛細胞和皮膚離子細胞功能改變的有力工具。這種斑馬魚動物模型可以在未來的生態毒理學研究中應用，以早期預測神經毒性藥物污染物對魚類的亞致死效應。

測試液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO₄, 0.2 mM MgSO₄, 0.16 mM KH₂PO₄, 0.16 mM K₂HPO₄, 0.1 mg/L tricaine, pH 7.0

儀器采購信息

據中關村NMT產業聯盟了解，中國臺灣師范大學生命科學系林豊益教授于2019年采購了旭月公司的非損傷微測系統。