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高效液相色譜法測(cè)定豆類食品中的游離神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸
閱讀：191 發(fā)布時(shí)間：2024-5-8神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸是人體內(nèi)的重要組成物質(zhì)，參與各種代謝途徑，可通過調(diào)控中樞神經(jīng)元的興奮或抑制，參與神經(jīng)元信息傳遞、認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶等過程。神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸主要有γ-氨基丁酸、天冬氨酸和天冬酰胺等，可分為興奮性和抑制性兩類，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸包括天冬氨酸等，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸包括 γ-氨基丁酸等。γ-氨基丁酸參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶過程[8?9] ，γ-氨基丁酸還能改善睡眠和預(yù)防抑郁 ，天冬氨酸與智能、情緒和警覺性有關(guān)。天冬酰胺可通過天冬酰胺合酶由天冬氨酸合成，該酶的缺陷會(huì)導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)異常和認(rèn)知障礙。
神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，在非神經(jīng)系統(tǒng)中也有重要的生理意義。γ-氨基丁酸能調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)和改善胰島功能。人類飲食不僅直接影響身體狀況，也會(huì)影響大腦功能和精神狀態(tài)。食品是神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的天然來源，飲食調(diào)整和補(bǔ)充在神經(jīng)疾病等許多疾病的治療中有積極的作用。神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸廣泛存在于食品中，其中黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等豆類食品不僅含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，同時(shí)也是人們膳食中普遍常見且需要的部分。因此，建立 黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆這 4 種豆類食品中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的檢測(cè)方法非常有必要。
目前，氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS） 法、離子色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法等。其中，液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)氨基酸需要做柱前衍生化處理，前處理過程復(fù)雜，而氨基酸自動(dòng)分析儀法耗時(shí)比較長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)方法
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別稱取適量的天冬氨酸、天冬酰胺和 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成 1 mg/mL 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于 4 ℃ 冰箱中。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋成 0.5 mg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
液相色譜條件
色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）；柱溫：25 ℃；
流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。流動(dòng)相為：A 為 0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 為甲醇；梯度洗脫程序：0~1 min, 30% B；1~2 min，30%~90% B；2~3 min，90% B；3~4 min，30% B。
色譜柱的選擇
分別使用 SB-C18（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）、Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）和 Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）三種不同的色譜柱對(duì) 1 μg/mL 的天冬氨酸、天冬酰胺和 γ-氨基丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，考察色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果及峰形的影響。
流動(dòng)相的優(yōu)化
首先分別使用水-甲醇和水-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，考察對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)強(qiáng)度的影響，然后分別使用 0.1% 甲酸水溶液-甲醇、0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，考察對(duì)目標(biāo)化合物分離度和峰形的影響。
柱溫的選擇
分別使用 20、25、30、35、40、45 ℃ 柱溫進(jìn)行檢測(cè)，考察柱溫對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)強(qiáng) 度的影響。
質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：4500 V；霧化氣（N2 ）壓力：55 psi；氣簾氣（N2 ）壓力：35 psi；輔助加熱氣 （N2 ）為 55 psi；
樣品前處理，采用水作為溶劑，超聲提取目標(biāo)化合物。分別稱取粉碎后過 60 目篩的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆粉末 2.5 mg 于 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 超純水，渦旋混勻后，超聲提取 30 s，以 13500 r/min 離心 10 min，取上清液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾，供 UPLC-MS/MS 分析。