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熒光激活的細胞分類儀檢測調亡細胞

閱讀:182          發布時間:2017-7-18
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一、轉化細胞原位缺口翻譯檢測裂解的dna片段 
1.取106經促調亡物質處理的細胞,用1% BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD4或抗CD8單克隆抗體,4℃ 20分鐘。用1% BSA-PBS洗滌細胞。置冰上。 
2.加入0.1ml 1%多聚甲醛,置冰上5分鐘,加入60%(v/v)甲醇溶液,輕輕懸浮細胞,4℃固定細胞15分鐘。4℃離心500×g 10分鐘,去上清液。 
3.加入0.1ml 0.1% Triton X-100,4℃15分鐘。用1% BSA-PBS洗滌細胞2次。加入50μl缺口翻譯緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4,5mmol/L MgCl2, 1.5U大腸桿菌DNA多聚酶I,50nmol/L 生物素-14-dUTP,50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP),37℃反應60分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次,懸浮于0.1ml預冷的1% BSA-PBS中。 
4.加入10μl抗生素蛋白-PE,4℃ 30分鐘,用冷PBS洗滌細胞。 
5.上樣于FACS儀,用FACScan LysisⅡ軟件分析。可以同時了解調亡細胞的類型。 
二、末端脫氧核苷酸轉移酶檢測法檢測裂解的DNA片段 
1.在37℃,含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中,用促調亡物質喜樹堿處理人PBMC 4小時。或用10-5g/ml地塞米松處理小鼠胸腺細胞4小時。 
2.取106經處理的細胞,用1% BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD或抗CD8單克隆抗體,4℃ 20分鐘。用冷1% BSA-PBS洗滌細胞2次。置冰上,加入0.1ml 1%多聚甲醛,4℃ 15分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次,加入冷70%(v/v)乙醇溶液,輕輕懸浮細胞,-20℃固定細胞24小時。4℃離心500×g 10分鐘,去上清液。 
3.用PBS洗滌細胞2次。加入50μl TdT反應液懸浮細胞,37℃反應30分鐘。用PBS洗滌細胞2次,懸浮于0.1ml PBS中。 
4.加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC,室溫反應30分鐘,用PBS洗滌細胞。 
5.上樣于FACS儀,分析調亡細胞的類型和調亡情況。 

三、7-AAD染色法 
1.取5×105經不同處理的細胞,用PBS洗滌細胞1次,加入10倍量PBS,離心500×g 5分鐘,去上清液。 
2.用0.5ml含20μg/ml 7-ADD的PBS懸浮細胞,4℃避光放置20分鐘。 
3.轉化細胞直接在FACS上用650nm濾光片檢測紅色熒光,用Lysis Ⅱ軟件分析,可區分活細胞(R1)、早期調亡的細胞(R2)和后期調亡細胞/死細胞(R3)。 

四、PI染色法 
1.取2.5×105~3.5×105經不同處理的細胞,接種在24孔細胞培養板的各孔中,在37℃ 5% CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24~48小時。 
2.每孔加50ml 100mg/ml PI。直接在FACS上用FL2濾光片檢測紅色熒光,用Lysis Ⅱ軟件分析,可區分活細胞(R1,不著染)和死細胞(R2,著染)。 

五、Annexin V、7-AAD(或PI)聯合染色法 
1.配制10倍濃縮的結合緩沖液:含140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl2的0.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH緩沖液,4℃保存,用前用雙蒸水稀釋10倍。 
2.用預冷的PBS洗滌經不同處理的待測細胞,洗2次。用結合緩沖液將細胞配制1×106/ml。取0.1ml細胞懸液置5ml培養管中。 
3. 
加入5μl AV-FITC,再加5μl 7-ADD或10μl PI。稍稍混懸細胞,置暗處,室溫(20~25℃)15分鐘。 
4.立即加入0.4ml結合緩沖液,終止反應。立即在FACS上分析。注意設立對照:未經處理的細胞對照,排除自發調亡;不加染色劑的對照;只加AV的對照;只加7-ADD或PI的對照等。 
六、轉化細胞溴乙啶/吖啶橙染色法 

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