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①. 人正常組織來源細胞基因載體的構建：把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設計為替換型載體。
 
②.ES 細胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，zui常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎人正常組織來源細胞也逐漸被發(fā)展應用。
 
③.同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入同源的胚胎干細胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內源基因組中，從而得以表達。
 
④.選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率為10-2 ～10-5 ，植物的概率為10-4 ～10-5 。因此如何從眾多細胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法(PNS法)，標記基因的特異位點表達法以及PCR 法。其中應用zui多的是PNS法。
 
⑤.表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學形狀的改變，達到研究目的基因的目的。
 
⑥.人正常組織來源細胞得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。