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雞卵泡顆粒細胞分離

時間:2017-3-29閱讀:606
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細胞系實驗動物
 
產蛋期母雞,普通飼料喂養,自由進食進飲;實驗前禁食12h
 
細胞系實驗步驟
 
1.翅下靜脈注射2mL EDTA-2Na(W/V,2%)溶液處死母雞,新潔爾滅消毒液浸泡消毒5min,打開腹腔,剪取整個卵巢,小心剝離卵泡(以8-15g為*),置于裝有PBS緩沖液的無菌培養皿中; 

2.用加有雙抗的PBS緩沖液沖去血污,漂洗3次;將漂洗干凈的卵泡移入裝有預冷PBS緩沖液的平皿中,剝凈卵泡外膜、結締組織及血管網;
  
3.用手術刀在卵泡表面劃一道1-2cm長的切口(動作要快),釋放卵黃,用PBS緩沖液將剩余的卵黃液漂洗干凈,剩下的卵泡膜即為:基膜和卵泡顆粒細胞層;

4.將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎,置于15mL離心管中,加4mL培養基,用1mL移液槍反復吹打1min,自然沉降5min,收集上清液備用; 

5.向離心管內加入4mL 0.2%Ⅱ型膠原酶,重懸沉淀,置于37℃恒溫水浴鍋中消化30min,每5min震蕩一次; 

6.消化結束,加入4mL M199*培養基(含10%血清)終止消化;用200目不銹鋼篩過濾,收集濾液,1200rpm離心5min; 

7.細胞系沉淀用M199洗2次,室溫離心,1200rpm,5min;棄上清,加入M199*培養基(含5%FBS及1%雙抗)重懸后接種于6孔塑料培養皿,置于37℃、5%CO2培養箱內靜置培養;12-24h換液,隨后每天觀察,2-3天換液一次,待細胞生長融合用于實驗。

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