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原代細胞爬片注意事項

時間:2017-3-1閱讀:606
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原代細胞*,蓋玻片需要過酸,并且自來水、蒸餾水沖洗干凈。兩張或者以上的玻片很容易因為虹吸作用粘到一起,很容易沖不干凈,很容易把兩張*重疊在一起的玻片當成一張,一定要看清楚,晾干片子是在消毒飯盒中進行,飯盒底面放上紗布,將玻片斜靠在飯盒側壁,玻片正面不要接觸紗布,否則會粘上毛毛的。然后高壓蒸汽滅菌,烤箱中烤干。
第二,爬片前用多聚賴氨酸或者層粘蛋白或者膠原溶液處理玻片,未處理過的細胞不容易貼壁,細胞系還好,原代細胞很少能貼得牢。這一步至關重要,否則在后面用PBS洗片時很容易將細胞洗掉。用這些促進細胞貼壁的溶液處理玻片后,放到培養皿之前需要用培養基沖洗一到三遍!層粘蛋白和膠原還好,多聚賴氨酸有幾次我沒沖結果細胞全部不貼壁。
第三,傳代消化下來的細胞一定不要過多稀釋,將濃一點的細胞懸液吹打混勻后滴在玻片上,幾個小時后再追加培養基。
第四,玻片在培養皿中容易漂起,如果事先在皿中鋪上液體很可能會不容易揭下來,或者揭下來時出印子在鏡下很難看。漂起的玻片很容易兩面都培養出細胞的,這時背面的細胞必須去除,挺難操作的,用PBS沖洗可能會傷到正面的細胞,用小鑷子夾玻片很容易夾碎,也很容易脫落,小心點好。
第五,將玻片拿出后一定要記好哪邊是正面,做玻片時將玻片切成長方形的。目前市場售的多為18mm x 18mm的蓋玻片,或者24mmx24mm的蓋玻片,正方形,很難分辨反正面,在某個角上打個缺口,對正方形是不中用的。可以用小砂輪切一下改成長方形,至于在某個角上用砂輪做個標記,理論上很簡單,實際操作有難度。
第六,上面步驟都沒問題后,玻片就需要進一步處理了,這里有幾個細節,分述如下:
1.PBS對玻片是沖洗還是浸泡,我個人認為浸泡好,我吃過沖洗的虧,每一步后都要沖洗2-3次,有時還沒等試驗做完,大部分細胞已經被沖掉了,呵呵!我當時欲哭無淚啊!
2.4%的多聚甲醛或者別的固定液的溫度是多少,有人認為4°C的好,有人認為37°C的好,我個人感覺,嬌貴的原代細胞先在常溫下固定較好,然后放到4°C冰箱中。我發現直接用4°C的溶液會造成細胞冷休克,從片上脫落。
3.用中性樹膠粘蓋玻片與載玻片時,盡量少滴樹膠,一點點就夠了,而且至少半個小時以上才能粘牢,防止在水中脫落。否則蓋玻片就會移動,背面會出現樹膠的印子,鏡下很難看,而且擦不掉的。

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