小鼠磷酸化原癌基因（c-Met）試劑盒實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬雄烯酮(ADT)水平。用純化的豬雄烯酮(ADT)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入雄烯酮(ADT)，再與HRP標記的雄烯酮(ADT)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的雄烯酮(ADT)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中豬雄烯酮(ADT)濃度。 

標本要求 

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

小鼠磷酸化原癌基因（c-Met）試劑盒計算

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 

注意事項

1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

小鼠磷酸化原癌基因（c-Met）試劑盒保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月