培養基的配制實驗步驟

時間：2017-4-25閱讀：768

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(一) 準備和安裝濾器

在超凈工作臺內打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無損。

(二) 合成培養基的配制

1、取3000ml三蒸水，加入合成培養基干粉，用磁力攪拌一定時間(2-4h)使之充分溶解。

2、通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調pH至6.0左右。

3、加入一定量的NaHCO3調節pH至7.0左右。

4、加水至zui終體積。

5、在超凈工作臺中對溶液進行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲存(可以-20℃儲存)。

(三) 小牛血清的處理

市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。

1、將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、處理后的血清儲存于4℃;

3、小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質量。

(四) 生長培養基的配制

除無血清培養之外，各種合成培養基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、注意事項

1、培養細胞使用的瓶子和飯盒應與提取RNA和培養細菌的瓶子和飯盒嚴格分開。因為用于處理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一種致癌物，可能影響細胞生長;而培養過細菌的用品也不應與細胞混用。

2、過濾時壓力不可過大，否則細菌易濾過達不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴。

3、濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。

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