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熒光顯微鏡的應用要點須知
閱讀：1210發布時間：2021-12-4
1)熒光顯微鏡預檢查和調節
(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設置等狀況。
(2)所需要的熒光激發/發射濾光片組件是否已裝在轉換器中，物鏡配置是否得當，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環與物鏡相反的共軛情況。
(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。
(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網膜。
(6)電壓不穩會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源最好加配穩壓器。
(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關閉；汞燈熒光電源一旦關閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復至原態，否則會影響燈的壽命。
2)熒光鏡像觀察
(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發光強度趨于穩定，裝載樣品進行觀察；為防止在調焦和尋找物像過程中過度激發光照會造成樣品熒光淬滅，最好先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發光調節到適度強度，有規律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調節到最佳熒光狀態用于拍攝記錄。
(2)鏡像質量不佳的調整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調節措施是：
?、倥懦上窆饴分械恼诠饣蛳薰馄骷?，如DIC附件、ND濾光片等。
?、谥匦抡{節熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。
?、奂毿恼{節物鏡覆蓋差校正環。
④復查熒光激發/發射組件是否與所標記的熒光色素對應。
(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場光闌和物鏡(100X物鏡)的數值孔徑光闌調節環，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發面積防止附加樣品淬滅。
(4)暫時不觀察時，應阻斷激發光路。
(5)油鏡觀察時，須用“無熒光油”，尤其是在U、V激發時，因常規鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3)熒光顯微鏡的熒光照相和數字CCD相機圖像采集
(1)熒光照相
?、俦M管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場相差無幾，而實際上曝光時間要增加數倍甚至幾十倍，應使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。
?、诟鶕晒馕锵裨跍y光區的分布比例和鏡像的明暗程度設置曝光補償調節，原則上適當增補償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
?、廴绻麤]有照明標線取景器，可先選擇較明亮的熒光區域進行對焦調整。
④對點狀熒光物像或撲捉某點為主的拍攝，可選擇適當的點測光模式。
?、輰υ谕环枰瑯訔l件拍攝的分散點狀熒光物像，可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。
?、奁毓膺^程應避免任何振動，有條件可配置防震臺。
(2)數字CCD相機圖像采集
?、俟鈱W接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
?、诓捎煤线m的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理條件，根據鏡像情況設置Binning、Gain、Gamma等參數。
?、垡駽CD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過于明亮，為獲取對比度較好的采集圖像，可適當縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強影響拍攝樣品細節的情況時。
實際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質量需要對上述調節機制的綜合運用，反復摸索、優化條件。
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