水相流動(dòng)相的使用，是采用反相色譜法進(jìn)行離子化合物分析檢測(cè)的關(guān)鍵步驟：包括pH值對(duì)分析物保留的影響、緩沖鹽的類型與濃度、緩沖鹽在有機(jī)溶劑中的溶解度及其對(duì)檢測(cè)的影響等。緩沖鹽種類、離子強(qiáng)度和pH值等選擇不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)極性化合物和可電離化合物進(jìn)行反相分離時(shí)，存在不良或不可重現(xiàn)的保留和拖尾現(xiàn)象。
分析物部分離子化，分析物與固定相自由硅醇基和其他活性位點(diǎn)之間較強(qiáng)的作用力等問(wèn)題，可通過(guò)選擇合適的緩沖范圍、正確的緩沖鹽種類及其濃度（離子強(qiáng)度）來(lái)改善。靈敏的LC-MS分析，更加注重酸、堿、緩沖鹽種類和其他添加劑的選擇：緩沖液不能抑制分析物的電離。
反相模式中，離子化合物的保留主要由流動(dòng)相pH值來(lái)決定。離子官能團(tuán)的解離性能同樣影響化合物的保留。非離子化合物的保留幾乎不受流動(dòng)相pH值的影響。對(duì)于含酸性基團(tuán)的化合物（羧酸鹽居多），pH值低于化合物pKa可增強(qiáng)保留，對(duì)于含堿性基團(tuán)的化合物（胺類居多），pH值高于化合物pKa可增強(qiáng)保留。
在pH值離pka較遠(yuǎn)的位置，較小的pH值變化對(duì)非質(zhì)子-質(zhì)子種類的比例影響很小。因此，中等pH值變化不會(huì)對(duì)保留產(chǎn)生明顯影響。pKa附近pH值的微小變化，會(huì)對(duì)兩種物質(zhì)的比例產(chǎn)生明顯的影響。因此，改變接近pKa的pH值，會(huì)明顯影響化合物的保留。當(dāng)pH值作為增加化合物保留的手段時(shí)，考慮方向應(yīng)該是盡量降低分析物的離子化。緩沖液是弱酸與其共軛堿，或弱堿與其共軛酸的溶液。
緩沖液降低氫離子、水合氫離子和氫氧根離子的影響，從而較少包括稀釋在內(nèi)的pH值波動(dòng)。反相模式下，經(jīng)典的硅膠基質(zhì)填料的pH值耐受范圍是2-8。緩沖液的選擇通常由所需的pH值決定。緩沖液的pKa必須接近所需的pH值，因其在pKa處最容易控制pH值。經(jīng)驗(yàn)法則是選擇一個(gè)pKa值<2個(gè)單位的所需流動(dòng)相pH的緩沖液。
緩沖鹽應(yīng)用一般思路
1 | 緩沖鹽濃度一般為10-50mmol/L。根據(jù)樣品性質(zhì)及進(jìn)樣量選擇緩沖鹽濃度，使其滿足應(yīng)有的緩沖能力。 |
2 | 梯度洗脫中有機(jī)相比例允許的最高值，應(yīng)根據(jù)緩沖鹽與有機(jī)相混溶實(shí)驗(yàn)確定。取不同緩沖鹽-有機(jī)相比例，確定有機(jī)相比例允許最高值，如緩沖鹽：有機(jī)相為10：90、20：80、30：70等不同比例。不得在儀器上隨意設(shè)置高比例有機(jī)相，以防緩沖鹽析出損壞儀器。 |
3 | 根據(jù)截止波長(zhǎng)、pH值和緩沖能力等多個(gè)約束條件選擇緩沖鹽，如檢測(cè)波長(zhǎng)在末端吸收，則一般應(yīng)選用磷酸鹽。 |
4 | 常用緩沖鹽溶液有：0.1%磷酸/三氟yi酸/乙酸/甲酸溶液，0.02-0.05mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）等。 |
5 | 堿性化合物優(yōu)選鉀鹽，抑制拖尾效果更好。 |
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