透射電鏡全套（包埋+制片+拍照）實驗

項目介紹

透射電鏡（TEM）通過對組織細胞樣本進行樹脂包埋切片，60-80nm厚度的超薄切片，經(jīng)過重金屬鉛、鈾染色后于透射電子顯微鏡中進行幾千至幾萬倍的放大成像，從而能夠清楚的觀察到在普通光學(xué)顯微鏡下無法看清的動植物細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，比如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、自噬小體、凋亡小體、葉綠體、液泡、細胞內(nèi)細菌或病毒侵染等結(jié)構(gòu)及病理變化。透射電鏡超薄切片除了能夠顯示細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)之外，還可用于觀察病原微生物，如各類細菌真菌等。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、組織學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、材料科學(xué)等諸多研究領(lǐng)域，是觀察和研究物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的強有力工具。

信帆生物透射電鏡平臺主要設(shè)備包括超薄切片機Leica EM UC7，透射電鏡HITACHI HT7700 80kv，透射電鏡HITACHI HT 7800 80kv。其中透射電鏡HITACHI HT7700、HITACHI HT7800主要技術(shù)指標(biāo)如下：

　　分辨率：1.0nm(加速電壓120kV，晶格像)

　　放大倍數(shù)：200～200,000 高反差模式

　　4000～600,000 高倍模式

　　50～1,000 低倍模式

　　加速電壓：40-120KV

　　實驗流程

　　包埋-制片-拍照

　　送樣運輸要求

　　送樣時請下載詳細填寫附件中的送樣單并與樣品一起送達信帆生物超微病理實驗室。

1、 動物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取材前可提前準(zhǔn)備裝有電鏡固定液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿的固定液中進行切割成小塊，取樣組織體積控制在以下尺寸(1mm×1mm×1mm正方體、1mm×1mm×3mm長方體狀、1mm×2mm×3mm薄片狀)。固定液滲透能力有限，超出此范圍后組織會無法固定，后續(xù)實驗無法完成，務(wù)必請重視此過程

② 取材時盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進行固定）。

③ 取材時一定注意避免鑷子擠壓等機械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫避光固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。4°時樣本可保存1個月左右

2、 植物組織樣本

① 取材要求同動物組織樣本。

② 組織投入固定液后需要進行真空抽氣讓組織沉底，如無條件抽氣可用濾紙將組織塞進固定液內(nèi)，組織不能漂浮在固定液表面。（抽氣做出來的效果會好一些）

3、 細胞樣本

貼壁細胞：

（看細胞凋亡的，需要把培養(yǎng)液中的細胞也離心收集后固定）

方法一：消化法（實驗?zāi)康牟簧婕坝^察細胞膜相關(guān)的內(nèi)容如：觀察緊密連接）

①培養(yǎng)好的細胞（細胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入胰-酶消化。

②胰-酶消化好后（時間不宜過長），加培養(yǎng)基終止消化，吸管輕輕吹打至細胞起浮。吸入離心管，低速離心（不超過3000轉(zhuǎn)），3-5min左右，細胞團要有綠豆大小。

③棄上清，加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫），細胞團吹散重懸。

④室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4°℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

方法二：刮取法

①培養(yǎng)好的細胞（細胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫）。

②常溫避光固定5min左右，用細胞刮（或軟橡膠蓋切得平整小方塊）沿一個方向輕輕刮下細胞，切記不要反復(fù)刮，避免細胞刮破。

③用巴氏吸管把細胞液吸入離心管內(nèi)，放入離心機（不超過3000轉(zhuǎn)），低速離心3-5min左右，細胞團要有綠豆大小。

④棄固定液后加新的電鏡固定液，細胞團吹散重懸。

⑤室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細胞：離心收集細胞要肉眼可見細胞沉淀有綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

4、 細菌樣本

長于固體培養(yǎng)基的細菌：連帶著培養(yǎng)基一起挑下細菌放于電鏡固定液內(nèi)室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存， 4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細菌孢子等：離心收集細菌要肉眼可見細菌沉淀綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

5、 病毒

破碎組織細胞，粗離心去除細胞碎片取上清，超速離心分離出病毒（病毒提取的過程需要客戶自己完成）。用緩沖液（如PBS）懸浮病毒，體積至少50ul，遠距離干冰凍存運輸，近距離4℃保存運輸，盡快滴片做負染后及時電鏡觀察拍照。（噬菌體 4度運輸）

6、 外泌體囊泡等

客戶自己完成外泌體囊泡等的提取收集，用緩沖液（如PBS）或者試劑盒中的保存液懸浮，，體積至少50ul，遠距離干冰凍存運輸，近距離4℃保存運輸，盡快制片做負染后及時電鏡觀察拍照。（因此類樣品極易降解，樣品越新鮮越好，最好數(shù)小時內(nèi)完成滴片負染，否則做出的效果很不理想甚至觀察不到）

7、 納米材料等無機材料

直接準(zhǔn)備粉劑，或用純水或無水乙醇懸浮，常溫保存運輸即可（需要超聲的備注）。做負染后電鏡觀察拍照。