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明膠酶譜檢測試劑盒正確的染色步驟!

時間:2019/12/23閱讀:1286
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明膠酶譜檢測試劑盒正確的染色步驟!

 

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

 

MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒檢測步驟


1、  制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。


2、待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。


注:因為全血成分復(fù)雜,MMP活性較低,的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照


3、低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。


4、洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。


5、 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常
37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。


6、顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

染色步驟:

 

1. 此染色液即為工作液,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝膠,并緩慢搖動2h;

 

2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;

 

3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進行脫色,直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要2~4h,也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景);

 

4. 對凝膠進行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對凝膠進行處理后保存。

 

安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

 

明膠酶譜檢測試劑盒正確的染色步驟!

 

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