明膠酶譜檢測試劑盒正確的染色步驟！

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒檢測步驟

1、  制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2、待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因為全血成分復(fù)雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

3、低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。

4、洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5、 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常
37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。

6、顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對凝膠進行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

明膠酶譜檢測試劑盒正確的染色步驟！