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瓊脂糖凝膠與核酸電泳小知識分享

閱讀：2265 發(fā)布時間：2023-3-20

　　影響核酸電泳遷移率的幾個因素

　　1、核酸分子大小

　　在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，DNA片段遷移距離和其含有的堿基對數(shù)量成反比，因此可以通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶遷移距離進行比較，由此得出目的條帶的大小，但這僅對雙鏈線性的DNA比較準(zhǔn)確(DNA Marker一般為雙鏈線狀DNA)，且對大于20kb的DNA不適用(普通瓊脂糖凝膠很難將其分開)。

　　2、核酸分子構(gòu)象

　　DNA分子在電場中的遷移速度不僅和分子量有關(guān)，還和它本身的構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的移動速度不一樣，移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA>線性DNA>開環(huán)DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太大時，環(huán)狀的DNA一般不能進入膠內(nèi)(停留在孔中)。

　　3、瓊脂糖濃度

　　同樣的線狀DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，DNA電泳遷移率的對數(shù)和瓊脂糖凝膠濃度呈線性關(guān)系，凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。

　　瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

　　凝膠濃度(%) 線性DNA長度(bp)

　　0.5 1000~30000

　　0.7 800~12000

　　1.0 500~10000

　　1.2 400~7000

　　1.5 200~3000

　　2.0 50~2000

　　4、電源電壓

　　在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率和所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分離率達到最大，所使用的電壓不得超過5V/cm。

　　5、電泳方式

　　用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。垂直型電泳，一般用聚丙烯酰胺凝膠做為支撐物。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。

　　6、嵌入染料的存在

　　常用的熒光染料EB可以嵌入到堆積的堿基對之間，使其剛性更強，并使其遷移速率有所下降。

　　7、電泳緩沖液的離子強度

　　電泳緩沖液的組成和離子強度也能影響DNA的遷移速度。在離子存在很少的情況下(如無用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中(如誤用10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)率很高并產(chǎn)熱明顯，嚴(yán)重時能引起凝膠融化或DNA變性。

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