本期為您推薦清華大學合成與系統生物學中心主任陳國強教授團隊發表在Metabolic Engineering 上的一篇文章：Engineering low-salt growth Halomonas Bluephagenesis for cost-effective bioproduction combined with adaptive evolution 。 本研究采用常壓室溫等離子體技術(ARTP)，對藍晶鹽單胞菌進行隨機突變，篩選得到在低鹽濃度下生長良好的菌株。對獲得的優勢菌株進行發酵生產PHA，實現了高產與成本降低的雙重增益。對比突變菌株與野生型基因型，揭示了嗜鹽宿主菌株的鹽脅迫相關基因。
聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是細菌中用于能量儲存的聚合物，可開發為綠色生物降解型塑料。其具備化工塑料的物化特性，但又有生物可降解性、生物相容性、光學活性、氣體相隔性等一系列性質。PHA生產菌株嗜鹽性單胞菌TD01是從中國新疆艾丁格爾湖分離的一種嗜鹽菌，在高pH和高鹽濃度下可在非無菌條件下快速生長。盡管現在已經在如表達載體與啟動子等方面對藍晶鹽單胞菌進行改造得到高性能菌株，但是在其耐鹽調節方面仍存在許多未知。而對藍晶鹽單胞菌的逆向改造如低鹽、高pH存活，可以進一步降低鹽廢水處理成本、更高的細胞分離度和更高的PHA純化度。
而由于細胞體內參與生物過程控制的細胞蛋白通常表現出不同的分配策略，以應對外部壓力，如鹽度的滲透壓，熱休克、紫外線照射等，對代謝網絡的理性設計以獲得鹽脅迫的調節就存在了一定的難度。常壓室溫等離子體技術（ARTP）是一種全基因組隨機突變方法，由于微生物耐鹽性的機制涉及系統級調控網絡，因此能夠實現全基因組隨機突變的ARTP更適合于藍晶鹽單胞菌的底盤改造。
研究人員以野生單胞菌TD01及3個重組菌TDH4，TD68，TD68-194為出發菌株，分別驗證其在高濃度（50g/L NaCl）和低濃度（10g/L NaCl）鹽環境下的生長狀況，結果顯示所有菌株在低鹽濃度的平板中均未出現菌落（圖2）。對這4株菌進行ARTP誘變，誘變時間5分鐘，致死率曲線顯示最佳處理時間為3分鐘（圖2）。在誘變后的庫中篩選出4株在低鹽濃度情況下生長最迅速的菌，進行第二輪誘變，最后得到4株菌： TD01A2B5, TDH4A1B5, TD68A2B3 and TD68-194A1B5（圖2）。 其中TDH4A1B5菌具有優良生產性能，細胞干重可以達到11g/L，含有60%質量百分比的PHA產量。
對突變菌株TDH4A1B5進行基因水平的改造，加入phaCAB操縱子，增強代謝通量，在7L體系中進行的40小時未滅菌補料分批發酵，相較于野生型的PHB和P34HB產量分別增加了21%和36%（圖3）。進一步對其進行改造使得蘇氨酸分泌率和外泌素分泌率分別提高了50%和77%，多方面的解析顯示了其低鹽濃度底盤菌的應用潛力（圖4）。通過基因比對，揭示了嗜鹽宿主菌株的鹽脅迫調控機制，包括101個與滲透壓相關的基因。更重要的是，通過使用重組嗜藍菌TDH4A1B5，在7L發酵體系下的PHA的成本降低了1/3，這顯著提高了其經濟競爭力（圖5）。
圖1 本文技術路線圖
圖2 ARTP誘變數據
圖3 對H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造來高產PHA
圖4 對H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造應用于多種蛋白的生產
圖5 低鹽發酵與高鹽發酵的成本分析
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.08.001
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