色譜法的分離原理是：溶于流動相中的各組分經過固定相時，由于與固定相發生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
高效液相色譜法的應用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。
與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調節，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調節樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。
HPLC色譜對流動相的一般要求，常見故障及維護：
流動相就比如人體的血液，其質量直接影響到整個系統的正常運行與否。
應該使用HPLC級的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換！一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑。
注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長,低于該波長后,溶劑會有很強的紫外吸收，從而影響極限的穩定性、干擾對所分析物質的檢測。
HPLC所使用的水必須是新鮮的和經過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時，必須把使用水的管路用有機溶劑置換，防止長霉。
儀器使用完后要采用適當的溶劑沖洗等方法維護色譜柱和系統。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。
儀器長期不用時，不建議使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
當有流路堵塞時，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH4至7)中尤其如此。
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