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流感病毒N2亞型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)反應流程常規程序

閱讀:1160      發布時間:2023-1-4
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流感病毒N2亞型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)反應流程常規程序:


將PCR反應所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后進入擴增循環。在每一個循環中,先于94℃保持30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復性溫度(一般50-60℃之間),一般保持30秒鐘,使引物與模板充分退火;在72℃保持1分鐘(擴增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一個循環。重復這樣的循環25~35次,使擴增的DNA片段大量累積。最后,在72℃保持3-7min,使產物延伸完整,4℃保存。


2.復性(退火)和延伸溫度


復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素,通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高,可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度,變成二步法PCR。


3.反應時間


變性步驟一般使用30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細胞做模板,變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定,一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。


4.循環次數


循環次數主要與模板的起始數量有關,在模板拷貝數為104~105數量級時,循環數通常為25~35次。


平臺效應(plateaueffect):PCR擴增過程后期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因:底物和引物的濃度已經降低,dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低,產生的焦磷酸會出現末端產物抑制作用,非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用,擴增產物自身復性,高濃度擴增產物變性不ce底


5.PCR反應液的配制


PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發。


對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時,如果將反應成分分開配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這個問題。

無水磷酸三鈉/三堿式磷酸鈉/原磷酸三鈉/磷酸三鈉/磷酸鈉/Trisodium phosphateAR,98%,500克國產/進口

2,2-聯喹啉-4,4-二羧酸鈉/4,4-二羧基-2,2-聯喹啉二鈉/2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉/BCABR,98%5克國產/進口

D(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/D-酒石酸鈉/2,3-二羥基丁二酸鈉/D-(+)-Tartaric acid disodium saltAR,99%500克國產/進口

L(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/L-酒石酸鈉/L-(+)-Tartaric acid disodium saltAR,99%500克國產/進口

偏釩酸鈉/二水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadate dihydrateAR,99.9%,25克國產

無水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadateAR,99%,25克國產/進口

四苯硼鈉/四苯基硼酸鈉/四苯硼酸鈉/NaTBPAR;99%,10克國產/進口

氟化鈉/Sodium fluorideGR,99%,500克國產

氫氧化鈉/苛性鈉/燒堿/鈉氧條/苛性曹達/固堿/火堿/Sodium hydroxideGR,97%,500克國產

氟硼酸鈉/四氟硼鈉/四氟硼酸鈉/Sodium fluoroborateCP,98%,500克國產

六偏磷酸鈉/偏磷酸六鈉/格來漢氏鹽/卡甘/磷酸鈉玻璃/格臘哈姆鹽/六偏/六聚偏磷酸鈉/Sodium hexametaphoshpateCP,95%500克國產/進口

萘酚AS-MX磷酸鹽/色酚AS-MX磷酸鹽/磷酸萘酚AS-MX/Naphthol AS-MX phosphate高純,99%500毫克國產/進口

萘酚AS-BI磷酸二鈉/萘酚磷酸鈉/7-溴-N-(2-甲氧基苯基)-3-(磷酸氧基)萘-2-甲酰胺二鈉鹽/Naphthol AS-BI phosphate disodium saltBR,99.5%100毫克國產/進口

單硬脂酸甘油酯/硬脂酸甘油酯/單甘酯/甘油單硬酯酸酯/十八酸甘油酯/GMSCP100克國產/進口

丁二酸二甲酯/琥珀酸二甲酯/琥珀酸甲酯/Dimethyl succinateCP,98%100毫升國產/進口

乙酰乙酸甲酯/乙酰醋酸甲酯/丁酮酸甲酯/β-丁酮酸甲酯/3-丁酮酸甲酯/MAACP,98%500毫升國產/進口

對羥基苯甲酸甲酯/尼泊金甲酯/4-羥基苯甲酸甲酯/對羥基安息香酸甲酯/泊金M/尼泊金/Methyl 4-hydroxybenzoateCP,98.5%100克國產/進口


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