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詳細介紹
無動物參與的皮膚致敏試驗方法
ADRA試劑盒
ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反應法）是應用了N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-cysteine【NAC】和α-N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-lysine【NAL】的化學品皮膚致敏試驗方法，該方法無動物參與，是動物皮膚致敏試驗的替代方法，符合OECD TG442C（經濟合作與發展組織化學品 TG442C測試準則）。
◆原理
皮膚致敏是由致敏物質與蛋白結合形成復合物（KE1）開始的，該復合物通過致敏物質與蛋白中的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基的共價結合所得。ADRA試驗利用NAC（半胱氨酸衍生物）和NAL（賴氨酸衍生物）替代蛋白，通過NAC、NAL和待測物質的反應來預測待測物質與蛋白的結合性。
ADRA試驗通過將NAC、NAL溶液與待測物溶液混合，在25°C下反應24小時，然后用HPLC法對反應溶液中殘留的NAC和NAL的濃度進行定量，從而對待測物質的皮膚致敏性進行評估。
◆優點
● 靈敏度高：在相對長的波長下（281 nm）檢測，可防止待測樣品和親核試劑的共洗脫。
● 沉淀少：ADRA試驗所需反應物的濃度僅為DPRA法的1%，可避免沉淀的產生。
● 重復性好：在HPLC分析前，通過添加終止液（2.5％TFA）來終止反應，因此檢測的可重復性好。
● 高通量：ADRA試驗使用96孔板和多通道移液器，可在短時間內測定多個樣品。
◆試劑盒組成
試劑名稱 | 容量 | 包裝 |
NAC | 10 mL用 | 2瓶 |
NAL | 10 mL用 | 2瓶 |
NAC 緩沖液 (pH 8.0) （預混合） | 300 mL用 | 2瓶 |
NAL 緩沖液 (pH 10.2) （預混合） | 300 mL用 | 2瓶 |
0.01 mol/L EDTA溶液 | 1 mL | 2瓶 |
◆使用方法
用水將預混合緩沖液溶解，再將NAC和NAL溶于其中，然后在96孔板與待測物反應24小時后，通過HPLC即可進行分析。
預混緩沖液、NAC和NAL都已經按照反應所需的量分裝好，只需進行溶解即可用于ADRA試驗。
◆操作視頻
● 緩沖液的制備
● Day1 反應溶液的制備
● Day2 反應的終止
◆其他需要用到的試劑·實驗器材
試劑
產品編號 | 產品名稱 | 規格 | 包裝 |
204-02743 | Trifluoroacetic Acid | 和光特級 | 25 mL |
015-08633 | Acetonitrile | 高效液相色譜儀用 | 3 L |
217-01031 | Ultrapure Water | 超微量分析用 | 1 L |
016-00346 | Acetone | 試劑特級 | 500 mL |
043-07216 | Dimethyl Sulfoxide | 試劑特級 | 500 mL |
* 蒸餾水或更高級別的水（ADRA試驗需要使用金屬含量低的水。）
* * 請勿在被測物質溶于水或乙腈時使用。
※ 需要用苯.乙醛 (CAS RN® 122-78-1)作為陽性對照化合物。
實驗器材
● 電子天平：精.準到0.1 mg
● 微量移液槍：量程為2～10 µL、10～100 µL和100～1000 µL的3種移液槍
● 12道移液器：量程為50～150 µL
● HPLC系統：配套96孔用遮光自動進樣器，以0.3 mL/min流速進樣
● UV檢測器：二極管陣列檢測器（PDA檢測器）或吸光度檢測器（281 nm）
● HPLC柱：Wakopak® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm（粒徑：3.6 μm）（產品編號：233-63991）
● HPLC柱：或同類型產品
● pH計：pH可讀取到±0.01，并配套校準用緩沖液
● 恒溫箱：溫度可設定為25℃
● 96孔板
● 500 mL PE瓶
● 試管混合器
● 微孔板封板膜：島津GLC封板膜（產品編號：568-RES001）或同類型具有高密封性和耐溶劑性的產品
● 微孔板振蕩器
● 微孔板離心機
※ | ADRA中用到的所有容器或器具（HPLC組件除外），要求使用PP或PE制的一次性用品。金屬離子的混入會使NAC二聚化從而導致無法正確進行評估。 |
◆產品列表
產品編號 | 產品名稱 | 規格 | 包裝 |
296-80901 | ADRA Kit | for Skin Sensitisation Test | 1 kit |
◆相關產品
ADRA色譜柱
◆相關應用
皮膚致敏試驗替代法ADRA應用實例：使用Wakopak® Core C18 ADRA色譜柱對"ADRA"中常見化合物進行分析