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技術(shù)文章

N端修飾蛋白(乙酰化、肉豆蔻酰化)的合成

閱讀:435          發(fā)布時(shí)間:2024-2-22

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N端乙酰化和肉豆蔻酰化是蛋白中最常見的翻譯后修飾之一,它們參與了蛋白的相互作用和亞細(xì)胞定位。為了闡明這些翻譯后修飾的重要性,需要比較分析修飾蛋白和未修飾蛋白。但是,在使用大腸桿菌等活細(xì)胞制備蛋白的常規(guī)方法中,受細(xì)胞中固有的修飾酶影響,難以控制和制備未修飾蛋白和修飾蛋白。


在本研究中,使用僅由參與蛋白合成的因子組成的PURE system(產(chǎn)品名稱:PUREfrex®),探討制備N端修飾目標(biāo)蛋白的方法,并以wan全可控的狀態(tài)成功合成了乙酰化或肉豆蔻酰化的蛋白。



◆由未甲酰化的初始蛋氨酸合成蛋白


在使用常規(guī)PURE system的蛋白合成中,與大腸桿菌內(nèi)的翻譯反應(yīng)相同,由甲酰化的蛋氨酸進(jìn)行翻譯。但是,如果初始蛋氨酸的氨基被甲酰化,則不會發(fā)生N端修飾。因此,使用不含甲酰基供體(10-Formyl-tetrahydrofolate10-CHO-THF)的PURE system進(jìn)行蛋白合成。結(jié)果表明,盡管不使用10-CHO-THF后合成效率有所降低,但仍成功合成了目標(biāo)蛋白。

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◆NatB的N端乙酰化


酵母NatB是一種由yNaa20和yNaa25組成的異源二聚體酶,它能將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至未甲酰化的初始蛋氨酸的氨基上。在不含10-CHO-THF的PURE system中加入目標(biāo)蛋白、yNaa20及yNaa25的模板DNA和乙酰CoA進(jìn)行反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成的目標(biāo)蛋白的N端肽,確認(rèn)添加NatB DNA后被乙酰化。


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◆NatA的N端乙酰化


酵母NatA是一種由yNaa10和yNaa15組成的異源二聚體酶,它將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至methionine aminopeptidase(MAP)切割初始蛋氨酸時(shí)暴露的第二個(gè)氨基酸的氨基上。因此,使用NatA進(jìn)行乙酰化時(shí),必須通過MAP去除N端的初始蛋氨酸。由于MAP會切割未甲酰化的初始蛋氨酸,因在不含10-CHO-THF的PURE system中添加目標(biāo)蛋白、yNaa10、yNaa15的模板DNA、純化MAP和乙酰CoA進(jìn)行反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成目標(biāo)蛋白的N端肽,確認(rèn)添加NatA DNA后被乙酰化。


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◆NMT的N端肉豆蔻酰化


NMT是一種可將MAP切割初始蛋氨酸后暴露出的第二個(gè)甘氨酸的氨基進(jìn)行肉豆蔻酰化的酶。由于底物肉豆蔻酰 CoA會抑制蛋白合成反應(yīng),因此需先在不含10-CHO-THF的PURE system中分別合成目標(biāo)蛋白和NMT。然后,將分別合成的目標(biāo)蛋白、NMT及肉豆蔻酰CoA混合,進(jìn)行肉豆蔻酰化反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成目標(biāo)蛋白的N端肽,確認(rèn)添加NMT后被肉豆蔻酰化。

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此外,在脂質(zhì)體中進(jìn)行上述的肉豆蔻酰化反應(yīng)時(shí),可觀察到肉豆蔻酰化的蛋白在脂質(zhì)體膜的定位狀態(tài)。


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● 實(shí)驗(yàn)步驟概述(A)

● 去除初始蛋氨酸的GFP通過hNMT1(Δ80)在脂質(zhì)體內(nèi)被肉豆蔻酰化,還可觀察到其向脂質(zhì)體膜遷移(B)

● 根據(jù)3、6、9、12和24 h的反應(yīng)時(shí)間繪制GFP膜定位的比率(C)

● 未添加肉豆蔻酰-CoA(D)或hNMT1(Δ80)基因(E)時(shí),無法觀察到GFP的膜定位



總結(jié)


該項(xiàng)研究結(jié)果表明,通過使用PURE system,可在wan全可控下制備N端修飾蛋白,還可以確認(rèn)翻譯后修飾的合成蛋白在脂質(zhì)體膜上的定位。此外,PURE system還能合成修飾酶,無需純化即可用于修飾反應(yīng)。該方法也適用于其他修飾酶,可以簡便地進(jìn)行各種翻譯后修飾反應(yīng)的分析和應(yīng)用。


該項(xiàng)研究是GeneFrontier、東京工業(yè)大學(xué)和海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)(JAMSTEC)的共同研究。論文發(fā)表在ACS Synthetic Biology,可通過以下鏈接免費(fèi)下載:
pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00191

“Regulated N-Terminal Modification of Proteins Synthesized Using a Reconstituted Cell-Free Protein Synthesis System"
ACS Synthetic Biology (2023) 12, 1935-1942



相關(guān)產(chǎn)品:

PUREfrex® 無細(xì)胞蛋白合成試劑盒http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1610.html




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