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青島捷世康生物科技有限公司
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紫外吸收法測定核酸的含量

時間:2016-6-16閱讀:3860
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紫外吸收法測定核酸的含量

目的要求

        學習紫外線(UV)吸收法測定核酸濃度的原理。

實驗原理

    核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質,其吸收高峰在260nm波長處。核酸的摩爾消光系數(或稱吸收系數)用(p)來表示。(p)為每升溶液中含有1g原子核酸麟的光吸收值(即A值)。測得未知濃度核酸溶液的A260nm值,即可以計算出其中RNA或DNA的含量。該法操作簡便,迅速,并對被測樣品無損,用量也少。

    蛋白質也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處,在260nm出的吸收值僅為核酸的1/10或更低,因此對于含有微量蛋白質的核酸樣品,測定誤差較小。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上。DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右,當樣品中蛋白質含量較高時,比值下降。若樣品內混有大量的蛋白質和核苷酸等吸收紫外光的物質,應設法先出去。

試劑和器材

1、試劑

    鉬酸銨-過氯酸沉淀劑:取3.6mL,70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中,即成0.25%鉬酸銨-2.5%過氯酸溶液。

   5%~6%氨水:用25%~30%氨水稀釋5倍。

2、測試樣品

    RNA或DNA干粉

3、器材

    移液管0.5mL(×2),2mL(×3);容量瓶50mL(×3);離心機;水浴;分光光度計。

操作方法

(1)、準確稱取待測核酸樣品0.5g,加少量0.01mol/L  NaOH調成糊狀,再加適量水,用5%~6%氨水調至pH7.0,定容至50mL。

(2)、取兩支離心管,甲管加入2mL樣品溶液和2mL蒸餾水,乙管加入2mL樣品溶液和2mL沉淀劑。混勻,在水浴上放置30min。

(3)、在3000r/min下離心10min。從甲、乙兩管中分別吸取0.5mL上清液,用蒸餾水定容至50mL。選擇厚度為1cm的石英比色杯,在260nm波長處測定A值。

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