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間接ELISA法篩選陽性雜交瘤及測定單抗清河常數

時間:2015-7-24閱讀:1309
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間接ELISA法篩選陽性雜交瘤及測定單抗清河常數


   酶聯免疫吸附測定法,簡稱ELISA(enzyme-linkde innunosorbent assay),是把特異性的抗原抗體結合反應與酶促反應相結合,zui后以酶促反應的放大作用來顯示zui初的免疫反應,它既能用于抗原的測定又可用于抗體的測定。間接ELISA法及時能測定抗體的一種ELISA方法,現將可溶性抗原或細菌細胞包被于聚苯乙烯酶標板上,然后加入待測抗體液,在加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠抗體,zui后加入HRP底物,依據顯色反應的程度來判斷抗體的有無及活性的高低。間接ELISA具有敏感性高,可檢測抗體濃度在ug-ng/ml水平,重復性好,快速簡便等優點,是篩選陽性雜交瘤及測定單抗親和常數的常用方法。

材料與方法

間接ELISA篩選陽性雜交瘤

1、抗原包被 如是可溶性抗原、根據其面議原性用碳酸鹽緩沖液(0.01mol/L Na2CO30.01mol/L NaHCO3, PH9.6)溶解成0.1-20ug/ml,然后以每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯酶標板中,4℃guo夜。

如是細胞抗原,則將對生長期每孔含10個細胞加入酶標板,37℃ 5% CO2孵箱培養24-48小時,令細胞場面貼壁后,棄培養液,已含0.05%Tween-20的PBST液洗1次,加入0.05%戊二醇0.1ml,4℃置5分鐘,然后以PBST洗3次,每次3分鐘。

2 封閉 PBST洗包被板1次,每孔加0.1ml0.1%牛許晴血蛋白液(溶于PBS),4℃guo夜已封閉非特異性位點。

3 一抗溫育 將封閉好的酶標板以PBST洗1次,無菌下取融合細菌孔發黃的待測培養液加入酶標板,每孔0.1ml,一個待測樣品設兩個檢測孔。用無菌細胞生長孔培養液做陰性對照,如有陽性抗體對照也應設置陽性對照。37℃溫育1小時。

4 酶標二抗溫育 棄去待測上清,PBST洗3次,每次3分鐘。加入用PBS液稀釋成使用濃度的HRP標記的羊抗小鼠Ig抗體,37℃溫育1小時。

5 洗滌 棄去酶標二抗,PBST洗6次,每次3分鐘。大鼠ELISA試劑盒

6 顯色反應 避光下,先用現配鄰苯二胺(OPD)底物反應液,40mgOPD榮譽100mlPH5.0檸檬酸緩沖液中(含檸檬酸·H2O 2.10g,Na2HPO4·12H2O 7.61g),并加入30%H2O2150ul,然后每孔0.1ml加入酶標板,觀察顯色反應狀況,一般10分鐘左右即可每孔加入2mol/LH2SO4 0.1ml 以終止顯色反應。

7 結果判定 在酶標測定儀上一掃描波長492nm測量各孔吸光值,以待測孔吸光值高于陰性對照空0.5(可溶性抗原)或0.2(細胞抗原)為陽性結果。

間接ELISA法測定單抗親和常數

1 實驗操作流程基本上上訴實驗相似。

2 根據預實驗經驗,選擇3個城北比稀釋的抗原濃度包被96孔酶標板,如可溶線抗原可選擇1ug/孔,0.5ug/孔,0.25ug/孔包被,細胞抗原可選擇2x,1x,0.5x

3 大策純化抗體的起始濃度為1mg/ml左右,以1:50,1:100,1:400,1:800,1:1600,1::3200,1:6400,1:12800稀釋度加入酶標板,且每個稀釋度至少應設置2個測定空。

4 根據酶標儀測定結果,扣除陰性對照值,然后以吸光值縱坐標,以抗體稀釋度的對數為橫坐標作劑量反應曲線,計算每個抗原包被濃度下zui大吸光值一半時對所對應的抗體濃度。即抗體的相對親和力

5 根據公式計算前和常熟Ka Ka=(n-1)/2(nAb-Ab)。其中Ab,Ab分別為包被抗原濃度為Ag,Ag時,zui大吸光值一半時所對應的抗體濃度。N=Ag/Ag,n一般取2即可,zui后常數表示Ka=X±1.96SE.

注意事項

1間接ELISA篩選陽性孔融合細胞,陽性結果應至少重復兩次才比較可靠,否則容易出現假陽性結果。

2 測定親和常數時,抗原的包被濃度要選擇適當,每步要充分封閉,充分溫育,充分洗滌,以防記過出現偏差。

3 間接ELISA法一定要設置陰性對照,如有陽性對照,也應設置,以供參考。


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