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羧酸酯酶(CarE)活性測定試劑盒說明書

時間:2022/5/24閱讀:1201
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注意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。 測定意義:

哺乳動物CarE,也稱脂族酯酶(aliesterase),廣泛分布于組織和器官,屬于絲氨酸水解酶家

族。CarE 催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解,但不能催化水解乙酰

膽堿及其類似物。CarE 參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝,并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解

毒和代謝有關(guān),有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE 活性。

測定原理:

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固籃顯色;在450 nm 光吸收增加速率,計(jì)算CarE 活性。

自備儀器和用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和

蒸餾水。

試劑組成和配置:

試劑一:液體×1 瓶,4保存。

試劑二:液體15mL×2 瓶, 4保存;

試劑三:粉劑×2 支, 4保存,臨用前取1 支試劑三,加0.6ml 無水乙醇充分溶解;

試劑四:粉劑×2 支,-20保存,臨用前取1 支試劑四,加少量試劑二溶解;

工作液配制:臨用前配制,向1 瓶試劑二中,加入溶解后的試劑三和試劑四各1 支,充分溶

解,過濾4避光保存,可用1 周。

粗酶液提取:

細(xì)菌、細(xì)胞樣品制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL 試劑一,

超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30  );12000g 4離心30min

取上清液待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,

加入1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿;12000g 4離心30min,取上清液待測。

3、液體:直接測定

測定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到450 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37水浴中預(yù)熱30 min

3. 空白管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 蒸餾水和200μL 試劑二,迅速混勻,

450nm 處測定3min 內(nèi)吸光值變化,第10s 吸光值記為A1,第190s 吸光值記為A2A

空白管=A2-A1

4. 測定管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 上清液和200μL 試劑二,迅速混勻,

450nm 處測定3min 內(nèi)吸光值變化,第10s 吸光值記為A3,第190s 吸光值記為A4A

測定管=A4-A3

注意:空白管只需測定一次。

CarE 活性計(jì)算公式:

a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1 組織中CarE 活性


 

1 按蛋白濃度計(jì)算

CarE 活性單位定義:每 mg 組織蛋白在 37反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1

個酶活單位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (A 測定管-A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V )÷T

= 13.67×(A 測定管-A 空白管)÷Cpr

2 按樣本鮮重計(jì)算

CarE 活性單位定義:每g 組織在37反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義為1 個酶活

單位。

CarE 酶活(U/g 鮮重)= (A 測定管-A 空白管) ×V 反總×V 樣總÷V 樣)÷W÷T

=13.67×(A 測定管- A 空白管)÷W

2 細(xì)菌或細(xì)胞中CarE 活性

CarE 活性單位定義:每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在37反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義

為一個CarE 活性單位。

CarE 酶活(U/104 cell)= (A 測定管-A 空白管) ×V 反總×V 樣總÷V 樣)÷細(xì)胞密度(104

cell/mL÷T=13.67×(A 測定管-A 空白管細(xì)胞密度(104 cell/mL

3. 液體中CarE 活性

CarE 活性單位定義:每毫升樣品在37反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義為1 個酶

活單位。

CarE 酶活(U/mL )= (A 測定管-A 空白管) ×V 反總÷V ÷T

=13.67×(A 測定管-A 空白管)

V 反總:反應(yīng)體系總體積,205μL=2.05×10-4LV 樣總:上清液總體積,1 mLV 樣:加入

上清液體積(mL)0.005 mLCpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣品質(zhì)量(g);T:反應(yīng)時間

min),3min

b. 使用96 孔板測定的計(jì)算公式如下


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