主要用途
端粒酶活性TRAP實時定量檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，結合端粒重復序列擴增方法（TRAP），既方便、快速地進行各種DNA模板的擴增，又實時檢測和定量分析擴增產物，即端粒酶活性的經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于腫瘤、衰老等研究。產品即到即用，性能穩定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強，效果滿意，質量保證。
技術背景
端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白酶（ribonuleoprotein），與人體細胞永生化（immortalization）和轉化（transformation）有關。端粒重復序列擴增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶聯擴增的敏感高效的體外端粒酶活性的檢測技術。首先，非端粒單核苷酸引物作為端粒酶的底物而持續延長產生六堿基差異的片段；然后，延長所獲得的產物在非端粒單核苷酸引物和逆向引物的參與下進行特異性擴增。SYBR綠色熒光染料，作為DNA結合染料，可以和擴增子（amplican）上雙鏈DNA的任一小溝（minor groove）結合，而發出熒光信號。根據每一循環的熒光強度來確定擴增產物的產量，并用循環閾值（threshold cycle；Ct）表示。TRAP實時定量PCR技術十倍敏感于常用TRAP電泳技術，同時避免二聚體產生的假陽性干擾。
產品內容
裂解液（Reagent A） 毫升
反應液（Reagent B） 微升
染色液（Reagent C） 微升
補充液（Reagent D） 毫升
封隔液（Reagent E） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
微型臺式離心機：用于樣品沉淀收集
PCR管：用于樣品擴增操作的容器
熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應
實驗提示
樣品制備
1）細胞樣品制備
- 準備1個細胞培養6孔板的單孔細胞，直至生長至80％鋪滿率（1 X 105細胞）
- 小心抽去細胞培養液
- 用細胞刮脫棒刮落細胞轉移到1.5毫升離心管
- 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽去上清液
- 小心加入xx微升預冷的裂解液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
- 放進冰槽里孵育30分鐘
- （選擇步驟）放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- （選擇步驟）小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
- 移取5微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用
2）組織樣品制備
- 手術取出動物組織，并秤取50毫克待測組織
- 移入到一個液氮凍存管
- 即刻放進液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進DOUNCE 勻漿器
- 加入xx微升預冷的裂解液（Reagent A）
- 勻化80下
- 小心轉移到1.5毫升離心管
- 放進冰槽里孵育30分鐘
- 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
- 移取5微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 定量檢測
- 一次反應總量為25微升
- 移取xx微升反應液（Reagent B）到0.5毫升PCR管
- 加入1微升待測的細胞或組織裂解懸液（總量為250納克總蛋白；注意：嚴格避免RNA酶污染）
- 加入xx微升染色液（Reagent C）
- 加入xx微升補充液（Reagent D）到總量25微升
- 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
- 使用xx微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：參見注意事項9）
- 即刻放進熒光定量PCR儀
- 熒光定量PCR反應程序為：
- 采集數據，進行溶解曲線分析
- PCR產物置于－20℃保存備用
注意事項
- 本產品為20次PCR反應
- 操作時，須戴手套
- 本產品適合各種熒光定量PCR儀
- 建議整個操作在4℃下進行
- 必須使用帶濾芯的槍頭
- 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
- 使用時，避免污染母液
- 建議使用裂解液或無離子水作為陰性對照
- 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入封隔液（Reagent E）
- 配制完成后，即刻進行擴增反應，以確保反應物的活性
- 試劑避免反復凍融
- 通常樣品量范圍為1.6納克至1微克；理想范圍為250納克；如果沒有反應，可能樣品中存在PCR抑制劑，建議調整樣品量為100至200納克
- PCR擴增反應的初3個循環為定量基線；3至15個循環的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達到閾值所需的循環數為Ct值（參考圖像如下）：其中6號為陰性對照
- Ct值作為端粒酶活性的計量單位
- 用戶可以使用293細胞（10，100，和1000細胞數）作為陽性對照，以此建立標準曲線：橫座標（X軸）為細胞量對數，縱座標（Y軸）為Ct值
- 如果檢測卵細胞樣品，建議平均每個卵細胞使用5微升裂解液（Reagent A）裂解細胞，孵育60分鐘，取1/10至1/20的卵細胞量，進行定量擴增反應
- 本公司提供系列端粒酶活性檢測試劑產品
