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α-酮戊二酸脫氫酶活性測定試劑盒說明書

時間:2016/9/12閱讀:2283
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α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒說明書

 

分光光度法 50 管/48 樣

 

測定意義

 

α-KGDHEC 1.2.4.2)廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中,是三羧酸循環調控關鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶 A。

 

測定原理

 

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶 A 生成琥珀酰輔酶 A、二氧化碳和 NADH,NADH340 nm 有特征吸收峰,以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

需自備的儀器和用品

 

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

 

試劑一:50mL×1 瓶,-20℃保存;

 

試劑二:10mL×1 瓶,-20℃保存;

 

試劑三:1mL×1 支,-20℃保存;試劑四:液體 55.5mL×1 瓶,4℃保存;試劑五:粉劑×1 支,4℃保存;試劑六:粉劑×1 支,4℃保存;試劑七:粉劑×1 支,4℃保存;試劑八:粉劑×1 支,4℃保存;試劑九:粉劑×1 支,-20℃保存;

 

試劑十:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入 2.1mL 蒸餾水充分混勻待用,用不完的試劑仍-20℃保存。

 

工作液的配制:臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉移到試劑四中混合溶解待用。

 

樣本的前處理

 

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

 

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

 

2、將勻漿 600g4℃離心 5min。

 

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min

 

4、上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。

 

5、在步驟的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復 30 次),用于線粒體α-KGDH 活性測定。

 

測定步驟

 

1、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 340nm 處,蒸餾水調零。

 

2、工作液于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)孵育 5min

 

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 試劑十、60μL 樣本和 1.1mL 工作液,混勻,立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 時的吸光值 A2,計算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性計算

 

1) 按樣本蛋白濃度計算

 

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

 

α-KGDH 活性(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

 

2) 按樣本鮮重計算:

 

單位的定義:每 g 組織在反應體系中每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

 

α-KGDHU/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T=325×ΔA÷W

 

3) 按細菌或細胞密度計算:

 

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

 

α-KGDH 活性(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T=0.65×ΔA V 反總:反應體系總體積,1.2×10-3 L;εNADH 摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d

 

比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.06 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

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