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CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)來源于簡單的細菌免疫系統(tǒng)組分，經(jīng)過改造后可在真核細胞中實現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯。該系統(tǒng)是單RNA(single-guide RNA, sgRNA) 介導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng)，通過靶點特異的CRISPR RNA (crRNA)序列與靶序列進行堿基配對從而引導(dǎo)Cas9蛋白至特定的切割位點進行切割，然后通過經(jīng)典的非同源性末端接合 (NHEJ) 或同源重組 (HDR) 對斷裂的DNA進行修復(fù)。然而，NHEJ修復(fù)會造成核酸的插入或者缺失(Indel), 產(chǎn)生顯性負效應(yīng)突變或者新抗原表位的風險。雖然HDR修復(fù)度高，然而HDR修復(fù)效率極低且局限于有絲分裂細胞，限制了HDR修復(fù)的應(yīng)用。因此，修復(fù)致病基因點突變依然是一大難題。

美國哈佛大學David R. Liu課題組發(fā)表在《Nature》的” Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”論文創(chuàng)新性的開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器（base editor, BE），有效地解決了上述問題。

該研究組將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）的大鼠胞嘧啶核苷脫氨酶rAPOBEC1通過linker序列XTEN連接到催化失活Cas9（catalytically dead Cas9, dCas9）N端，構(gòu)建出了代單堿基編輯器base editor (BE1)（rAPOBEC1–XTEN–dCas9）（圖一）。

圖一

運用BE1進行體外實驗表明目標C堿基5端是G堿基時編輯效率顯著降低，BEI編輯效率遵循TC ≥ CC ≥ AC > GC (C為目標堿基)原則，此外目標C堿基位于sgRNA的第7位或者附近時編輯效率高（圖二）。體外細胞實驗研究表明，運用BE1可以使C→T的編輯效率達到0.8% - 7.7%（圖三）。

圖二

鑒于BE1的單堿基編輯效率較低，研究者們認為有可能是BE1編輯使CG堿基對轉(zhuǎn)換成UG堿基對，然而正常細胞會將UG識別為錯配堿基對，從而啟動體內(nèi)尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA glycosylase, UDG）識別U并將其切除，進而將其重新修復(fù)為CG。因此在BE1的基礎(chǔ)上，研究者們又融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI），構(gòu)建出了第二代單堿基編輯器BE2（rAPOBEC1–XTEN–dCas9-UGI）。實驗結(jié)果表明BE2編輯效率是BE1的3倍（圖三）。

BE2編輯過程中只改變了CG堿基對中的C堿，因此其理論上C→T的大轉(zhuǎn)換效率只能達到50%。為了進一步提高編輯效率，研究者們部分恢復(fù)BE2編輯器中Cas9的切割活性（dCas9-(A840H)），構(gòu)建出了第三代單堿基編輯器BE3（rAPOBEC–XTEN–dCas9(A840H)–UGI）。BE3中的Cas9可以切割包含G堿基的非編輯DNA單鏈，斷裂后的非編輯鏈（G所在鏈）會以編輯鏈（T所在鏈）為修復(fù)模板進行修復(fù)，因此理論上C→T的轉(zhuǎn)換效率可以達到100%，即CG可以*轉(zhuǎn)換為TA。研究結(jié)果表明BE3編輯效率是BE1的2-6倍（圖三）。

圖三

后，研究者們運用BE3對致病突變修復(fù)進行了研究。在體外細胞系的試驗發(fā)現(xiàn)BE3對阿爾茨海默病致病基因APOE4的改造效率可以高達74.9%，對癌癥相關(guān)致病基因TP53的改造效率為7.6%，而indel率維持在較低水平（4.6%及0.7%）（圖四）。

BE3單堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)為真正意義上的單堿基（T→C, A→G）致病突變基因的修復(fù)提供可能。

圖四

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