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CRISPR/Cas9技術問世以來，迅速成為生物科學領域的游戲規則改變者，7月31日，個成功將CRISPR/Cas9搜索功能用于實踐的生物技術初創公司-Mammoth Biosciences贏得了2300萬美元融資，更是讓CRISPR/Cas9技術進入烈火油烹的境界。然而，該技術導致雙鏈DNA的斷裂，一度成為阻礙CRISPR/Cas9技術發展的絆腳石。近日，學術期刊《Nature Genetics》發表的一篇文章表示科學家們發現了CRISPR/Cas9的第三條作用途徑！而且這條途徑中還存在可以修復斷裂的DNA雙鏈的關鍵蛋白！這對CRISPR/Cas9技術的進一步發展至關重要！

在談新途徑前，得先說說CRISPR/Cas9的“舊途徑”是什么。簡單點說，CRISPR/Cas9就是對DNA鏈進行切割和再修復，而所謂的“舊途徑”就是指DNA再修復的兩條常見途徑。

在DNA鏈斷裂后，CRISPR/Cas9有兩個選擇，要么直接添加堿基，破壞原有基因功能，通過沉默基因實現基因敲除，要么利用單鏈DNA模板，引入新的序列，對基因進行編輯。

這就是所謂的“非同源性末端接合（NHEJ）”與“同源介導修復（HDR）”。這兩種途徑存在很大的問題-一些DNA斷裂后無法或難以及時修復，這也是日益喧囂的“CRISPR/Cas9安全問題”的緣由之一。

那么，為什么NHEJ和HDR無法*修復所有切割后的DNA鏈呢？這就要怪CRISPR/Cas9系統的“動態平衡”了。這就像一個可逆的化學方程，當基因編輯進行一段時間后，切割和修復過程就會自行達到平衡，這也是所謂的“飽和”問題。

而平衡后，尚有已斷裂的DNA無人修復，從而導致一些基因功能的缺失。因此，要解決DNA斷裂問題，就是要讓這個平衡方程向修復方向da程度傾斜，而加州大學伯克利分校的研究人員們發現的CRISPR/Cas9新途徑-Fanconi貧血途徑就有此功能。

FANCD2在Cas9切割的雙鏈斷裂位點富集

Fanconi貧血途徑涉及21種不同的蛋白質，這些蛋白質的任何相關基因受損，都與一種罕見貧血癥-Fanconi貧血癥息息相關，這也是業內對該途徑的普遍認識。然而，此次研究人員關注的是Fanconi貧血途徑與CRISPR/Cas9的關系。

他們利用CRISPR干擾（CRISPRi）的技術對超過2000個基因進行切割，發現Fanconi貧血途徑中的FANCD2蛋白可長期存在于CRISPR/Cas9產生的雙鏈斷裂位點上，調節FANCD2蛋白可以提高HDR頻率。

也就是說，FANCD2蛋白可以打破CRISPR/Cas9系統存在的切割-修復平衡，使平衡向修復方向傾斜，提高基因編輯效率，降低不良反應。

Fanconi貧血途徑基因敲除影響HDR效率

Fanconi貧血途徑基因敲除不影響NHEJ效率

研究人員發現，Fanconi貧血途徑并不作用于NHEJ，而是通過提高HDR效率將修復轉向單鏈模板修復。Fanconi貧血途徑與NHEJ是競爭關系，只要Fanconi貧血途徑過度活躍，就會影響基因敲除的效率。另一方面，研究人員指出，FANCD2蛋白對HDR效率的影響力度超乎想象。

Fanconi貧血途徑在體內普遍存在，一旦Fanconi貧血途徑不夠活躍，FANCD2蛋白功能受限，HDR就處于報廢狀態！也就是說，無法引入新的序列，無法基因進行編輯，CRISPR/Cas9系統只能崩潰！所以，如何把控Fanconi貧血途徑的活性，是CRISPR/Cas9技術發展的重要課題！

Fanconi貧血途徑活性影響基因敲除和基因編輯

而且，在CRISPR/Cas9系統里，FANCD2蛋白能且只能在Cas9切開的位點積聚，那么它就可以作為Cas9切口的有效標志，這就可以幫助科學家們快速準確地找出靶向和脫靶的切口。

研究人員指出，這項研究有助于加深我們對CRISPR/Cas9機制的進一步理解，有望提高基因編輯的效率，從而開發出更多有效的療法，為更多疾病帶來希望。

（轉化醫學網）