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流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：PI單染色法
一、基本原理
其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變有特征性，主要包括以下幾個(gè)方面：
1、細(xì)胞核的改變
由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。
2、光散射特性
凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，前散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大；側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大，因此可根據(jù)前散射光和側(cè)散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細(xì)胞主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類。
二、試劑與儀器
1、PBS溶液
2、PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存
3、70%乙醇
4、400目篩網(wǎng)
5、流式細(xì)胞儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、收集細(xì)胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106個(gè)/mL｝，500~ 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
2、3ml PBS洗滌1次。
3、離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時(shí)。
4、離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。
5、400目的篩網(wǎng)過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS。
6、用1ml PI染液染色，4℃避光30min。
7、流式細(xì)胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。
8、結(jié)果判斷：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。
四、注意事項(xiàng)
細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。