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DNA 甲基化修飾
DNA 甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，能通過影響染色質結構、DNA 構想、穩定性以及蛋白質相互作用方式等，起到調控基因表達的作用。與多種腫瘤的發生、發展密切相關。
DNA 甲基化水平和模式的改變是腫瘤發生的一個重要因素。這些變化包括 CpG 島局部的高甲基化和基因組 DNA 低甲基化狀態。它是由 DNA 甲基轉移酶（DNA methy-transferase，Dnmt）催化，以 3-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體而發生反應。催化反應有 3 類，包括將腺嘌呤轉變為 N-甲基腺嘌呤、將胞嘧啶轉變為 N-甲基胞嘧啶以及將胞嘧啶轉變為 C-甲基胞嘧啶。在原核生物中這 3 種類型均存在，但是在高等真核生物中只存在第 3 種類型，即將胞嘧啶（C）轉變為 5-甲基胞嘧啶（5mC）。
如圖 1 左所示，在正常細胞中，位于抑癌基因啟動子區域的 CpG 島處于低水平或未甲基化狀態，此時抑癌基因處于正常的開放狀態，抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發生。而在腫瘤細胞中，該區域的 CpG 島被高度甲基化，染色質構象發生改變，抑癌基因的表達被關閉，從而導致細胞進入細胞周期，凋亡喪失，DNA 修復缺陷，血管生成以及細胞粘附功能缺失等，zui終導致腫瘤發生。
同樣，如圖 1 右所示，對于在正常細胞中處于高度甲基化的一些基因和重復序列，如果其甲基化水平降低，這些基因將表達和重復序列將激活，從而導致基因印記丟失，細胞過度增長，不合適的細胞特異性表達，基因組脆性增加，以及內寄生序列 (endoparasitic sequence) 激活，zui終也導致腫瘤發生。
由于 CpG 島的局部高度甲基化要早于細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預測，可以作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預后評估指標，對腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監測都具有重要的意義。而全基因組水平的低水平甲基化狀態，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進一步降低，使其可用于腫瘤的診斷以及分級。
隨著 DNA 甲基化研究的不斷深入，其檢測方法也層出不窮。現有方法，絕大部分都是取樣于細胞的 DNA，根據研究水平，又將這些方法歸為 3 大類，即：基因組甲基化水平 (Methylation Content) 的分析，候選基因甲基化的分析以及基因組層次的 DNA 甲基化模式 (Methylation pattern) 與甲基化譜 (Methylation Profiling) 的分析。
A. 基因組甲基化水平 (Methylation Content) 的分析:
1. 液相色譜 ( HPLC) ：HPLC 是一種比較傳統的方法，是根據 DNA 或 蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。由于在 動態相和靜態相下分子的光吸收度并不相同而加以 定量。隨著系統的壓強的增加，其分辨率增高。故 而能夠定量測定基因組整體水平 DNA 甲基化水平。
2. 毛細管電泳法 ( HPCE) ：這是一種利用窄孔熔融石英毛細管來從復合物中分離不同化學組分的技術。其基礎是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結構以及疏水 性等不同而相互分開。用 HPCE 方法處理 DNA 水解產物來確定 5mC 水平，簡便，經濟且敏感性高。 必須指出，以上方法雖然能夠明確檢測出目的序列中所有 CpG 位點的甲基化狀況，但并不能對甲基化位點進行定位。
B. 候選基因 (Candidate Gene) 甲基化分析:
1 . 甲 基 化 敏 感 性 限 制 性 內 切 酶 - P C R / Southern 法 ( MSRE-PCR/ Southern) ：這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將 DNA 消化為不同大小的片段后，進行 Southern 或 PCR 擴增分離產物， 明確甲基化狀態再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(CCGG) 和 SmaⅠ- Xmal(CCCGGG)。
2. 重亞硫酸鹽測序法 (Bisulphite Sequencing) ：該方法首先用重亞硫酸鹽使 DNA 中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，進行 PCR 擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，zui后，對 PCR 產物進行測序并且與未經處理的序列比較，判斷是否 CpG 位點發生甲基化。此方法是度很高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。
3. 甲基化特異性的 PCR (MS-PCR) ：同樣，該方法中，DNA 先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物特異性的 PCR。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化 DNA 鏈，另一對結合處理后的非甲基化 DNA 鏈。檢測 MS-PCR 擴增產物，如果用針對處理后甲基化 DNA 鏈的引物能擴增出片段，則說明回目錄 該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。
C. 基因組范圍的 DNA 甲基 化模式 (Methylation pattern) 與 甲 基 化 譜 ( M e t h y l a t i o n Profiling) 分析:
1 . 限 制 性 標 記 基 因 組 掃描 (Restriction Landmark GenomicScanning, RLGS) RLGS 是zui早適用于基因組范圍 DNA 甲基化分析的方法之一。該方法先用甲基化敏感的稀頻限制性內切酶 NotⅠ消化基因組 DNA，甲基化位點保留，標記末端、切割、行一維電泳，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的內切酶切割，行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割開并在電泳時顯帶，得到 RLGS 圖譜與正常對照得出缺失條帶即為甲基化的可能部位。
2 . 甲 基 化 間 區 位 點 擴 增 (ampl ification of intermethylated sites, AIMS) A I M S 是 基 于 任 意 引 物 PCR (Arbitrary Primed PCR) 的一種方法，由于任意引物 PCR 使用寡核苷酸連接子 (linker) 進行連接，不需要依賴任何序列的先驗信息。在該方法中，用來進行擴增的模板序列首先通 過甲基化敏感的限制性內切酶進行消化而富集，其特異性由該酶酶切片斷一端的特定序列 結合連接子來保證。隨后，由內切酶進行第二次消化，再次連接，提純進行 PCR 擴增，zui后電泳，提取目的序列進行測序。
3 . 甲 基 化 C p G 島 擴 增 (Methy lated CpG-i s land amplification, MCA) M C A 也是基于任意引物 PCR 的方法，該方法使用兩種對甲基化具有不同敏感度的限制性內切酶 (如 SmaI 和 XmaI) 先后進行消化，然后對甲基化敏感的限制性酶切片斷進行接頭 (Adaptor) 連接，行 PCR，那些富含 CpG 的序列就會被選擇性的擴增。該方法對甲基化分析和克隆甲基化差異性基因都非常有幫助。
通過以上論述，不難看到檢測甲基化的方法不斷涌現，一方面說明其研究難度之大，另一方面也說明種種方法都有其局限性，諸如對酶的依賴，PCR 擴增的問題，芯片數據分析的標準化問題等等。 綜上所述，各種表觀基因組學技術方法使我們可以繪制出諸如 DNA 甲基化以及組蛋白修飾模式的詳細圖譜，為我們研究甲基化的生物學功能，以及在腫瘤生成中的作用，以致腫瘤預防、診斷、治療和預后方面提供更多信息。