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貼壁、懸浮、原代細胞感染Protocol及常見問題解答
慢病毒是當前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細胞、神經元細胞、心肌細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而為基因功能的研究提供了更強有力的工具。然而仍有一部分細胞，尤其是原代細胞和懸浮細胞由于細胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑，然而細胞狀態卻變差了，且增加感染效率并沒有達到理解的效果，這是什么原因呢？
一、對慢病毒感染出現的問題進行原因分析
1. 細胞狀態變差——細胞毒性
- 雜質：病毒溶液中殘留的雜質蛋白、內毒素及宿主細胞DNA等是造成細胞毒性的主要因素。特別對于某些外源刺激敏感的細胞來說，嚴重時將導致細胞死亡。這是病毒感染細胞后，狀態差異的主要原因。
- 過度感染：外源基因過度表達，會導致目的細胞本身正常新陳代謝失衡。這是有些細胞過感會死亡的主要原因。
2. 病毒加了不少，效果不理想，如何增加感染效率——了解影響慢病毒感染效率的因素
- 細胞膜的流動性
- 細胞膜表面受體的表達豐度
- 病毒與細胞的接觸面積和接觸幾率
- 細胞膜與病毒外殼蛋白電荷的多少
二、如何有針對性地增加慢病毒感染效率
了解了影響細胞狀態和感染效率的原因后，我們就可以有針對性的進行調整。
1. 使用高滴度高純度的慢病毒，可以減少病毒中的雜質對細胞狀態的影響：降低慢病毒對細胞的毒性
2. 調整細胞狀態，感染時使用對數期的細胞：增加細胞膜的流動性
3. 降低感染時血清濃度，使用無血清/低血清的培養基：降低血清蛋白對病毒外殼蛋白的封閉
4. 離心法，感染時將細胞培養板密封，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養箱中正常培養：增加慢病毒與細胞的接觸幾率，但對細胞有一定的機械損傷，儀器要求高
5. 感染時加入Rentronectin等纖粘蛋白：增加慢病毒與細胞接觸幾率，但會影響細胞的貼壁狀態
6. 使用傳統的助感染試劑，如Polybrene：中和細胞膜和病毒粒子之間的電荷排斥，但Polybrene本身就具有細胞毒性，部分細胞對Polybrene敏感，容易導致細胞狀態變差、形態發生變化、甚至死亡。
三、特殊細胞慢病毒感染注意事項
1. 懸浮細胞
對于懸浮細胞，可采用離心感染方法提高感染效率。如將細胞培養板密封后，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養箱中正常培養。
2. 極難感染的細胞
對于極難感染的細胞，可采用多次感染的方法，即感染一次后，重新加入新鮮病毒再次感染，可顯著提升感染效率。但需要注意調整兩次感染間細胞狀態。
3. 傳代能力較差的原代細胞、非分裂細胞
原代細胞：由于細胞增長緩慢，可以在接種時提高匯合度到50%～60%，確保在感染后4天時細胞匯合度達到90%～100%；
非分裂細胞：如神經元細胞，接種后不再增殖，需要按照100%的匯合度進行接種。
Q：慢病毒如何稀釋？
A：用常規培養基、生理鹽水、Hanks液、PBS液等將慢病毒稀釋到需要的滴度。如原病毒標記滴度為5 x 108 TU/ml，則取20 µl病毒液加入到80 µl的常規培養基中，即可得到1 x 108 TU/ml的病毒稀釋液。
Q：如何確定向細胞中加入慢病毒的*時間？
A：慢病毒感染細胞后需要4天的時間才能觀察到慢病毒攜帶的基因表達，應在細胞匯合度20~40%時且細胞狀態良好時加入慢病毒，確保在感染后4天時細胞增長達到90%～100%的匯合度。
Q：加入慢病毒病毒后，細胞死亡很厲害，該如何處理？
A：這種情況是由于慢病毒對該細胞有一定的毒性作用，需要調整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小時、8 小時、12 小時對細胞進行觀察，若發現細胞狀態變差時，則需要立刻對細胞進行換液操作，使用新鮮的*培養液替換病毒感染培養液。
Q：如何提高慢病毒對細胞的感染效率？
A：慢病毒對細胞的感染效率受多個因素影響，如細胞自身生長的狀態，細胞數量，細胞被慢病毒感染的難易程度等。因此保證細胞正常增殖，輪廓清晰，合適的細胞密度，選擇*的感染條件可以更好的保證感染效率。對于懸浮細胞，可采用離心感染方法，減少病毒感染時的體積，從而提高感染效率。如將細胞培養板密封后，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養箱中正常培養。