您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
12
鎳柱純化常見問題及分析
1:通過His標簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進？
（1）如果純化的是上清，蛋白酶會部分降解目的蛋白，可通過加多種入蛋白酶抑制劑改進。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
（3）雜蛋白和目的蛋白結合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
2:鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?
(1)出現(xiàn)這樣的情況，主要是緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免DTT的參與（一般的鎳柱耐受小于5mMDTT,推薦緩沖液中不要超過2mMDTT）。
3:柱子堵了，怎么辦？
（1）柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心。
（2）上清液純化時，蛋白發(fā)生變性，有絮狀物產生，趕緊加入1-2mMDTT(上清樣品處理要在冰浴中進行)，還不行加尿素變性，使其在變形環(huán)境下。
（3）樣品處理時的料液比不要太小，否則黏度大，或者導致蛋白析出或變性，料液比要在1/10-1/15之間較適宜。
4：純化過程中，蛋白出現(xiàn)了渾濁，怎么辦？
（1）出現(xiàn)渾濁，說明蛋白處在不穩(wěn)定的環(huán)境中或者自身就不穩(wěn)定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環(huán)境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑DTT。
（2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現(xiàn)象。
5：沒能純化到帶His標簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？
（1）超聲的功率不對(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放)策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
（2）樣品或者是結合緩沖液不正確：策略：檢測pH及樣品和結合緩沖液的組成份（EDTA等）。確保在溶液中鰲合劑或強還原劑的濃度及起始咪唑的濃度不是太高。
（3）組氨酸的標簽沒有*的暴露策略：在變性條件下(用8M脲，6M鹽酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT進行純化。
（4）His標簽丟失,策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達，上游構建，改變his-tag的位(C-terminalorN-terminal)，必要時增加his個數(shù)(常用6-10個)。策略2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到*的結合金屬離子。
Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(shù)(組氨酸)6標記的重組蛋白質的金屬離子，也是一般zui常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用Ni2+。可以利用HitrapIMACHP來篩選不同的金屬離子，具體應用實例請參考《RecombinantProteinPurificationHandbook》。
6:蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決？
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上，結合力較強）策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來找出*的洗脫條件。
（2）降低PH的方法洗脫的,因為若PH低于3.5,會導致鎳離子脫落策略：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
（3）蛋白已沉淀在柱上 策略：減少上樣量和孵育的時間，試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)
或改變NaCl的濃度，或在變性條件下洗脫(用8M脲，或6M鹽酸胍)，zui終也可在洗脫Buffer中加入2mMDTT或者0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。
（4）非特異性疏水或其他相互反應策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%TritonX-100）或增加NaCl的濃度。
7：如何處理樣品，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）？
（1）上清樣品處理，要加入去污劑，蛋白酶抑制劑，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數(shù)。
（2）去大腸桿菌自身帶（兩條30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸浮（加入去垢劑），離心6000r/min,30min,10℃。（若效果不夠可繼續(xù)上述步驟）。
（3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍，也可用1M/2M/4M/8M尿素逐步溶解，可選取其中純度*的。
（4）可用硫酸銨測定法，可初步提純。