您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
12
MTT法簡介及操作步驟
一、MTT是什么
MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
二、MTT法用來做什么
簡單地說：是一種檢測細胞存活和生長的方法。 MTT主要有兩個用途
1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細胞毒性的測定； 2．細胞增殖及細胞活性測定。
三、為何MTT可以用來做上述工作
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。
四、實驗所需材料
1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。 市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g
1.1對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法：預(yù)先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復(fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT*混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。
1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。
注意事項：
1. 在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。 配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感
MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周內(nèi)（個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用。
MTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.
2．MTT甲瓚溶解液
2.1二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。
2.2三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。
該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。
五、MTT法實驗步驟
1.胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。
對于初學(xué)者而言，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數(shù)量。 以一般細胞培養(yǎng)常用的625px2為例，
1)細胞密度在長到約80%~90%（下圖所示為80%~90%密度時細胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。
2)另取一支新的15ml無菌離心管（為下一步接種96孔板用），裝入約9ml培養(yǎng)基.
3)從*步準(zhǔn)備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細胞計數(shù)，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當(dāng)于細胞計數(shù)板4個大格內(nèi)每大格平均5-10個細胞（見下圖）；如果不夠該濃度，再根據(jù)計數(shù)的結(jié)果滴加細胞懸液，每滴按50ul計算。
4)細胞數(shù)量因?qū)嶒災(zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以（相當(dāng)于細胞懸液密度為2×104/ml），細胞毒性實驗每孔5000—10000個（相當(dāng)于細胞懸液密度為5×104/ml）。此外，還應(yīng)根據(jù)細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數(shù)量。比如：生長較快的細胞密度可略小。
2．將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。
注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。
3.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)6個，否則難以反應(yīng)真shi情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。
4. 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
6. 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。
溶解結(jié)晶的方法有兩種，*種，用DMSO溶解
1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個人認為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決定。
2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
另一種方法，用三聯(lián)溶解液（見上面MTT甲瓚溶解液）
1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）
2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時間會長一些。
在實際的操作過程中，往往為了等待4—6小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經(jīng)摸索，加入溶解液后過夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。
7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。
六、MTT結(jié)果分析
關(guān)于如何計算IC50
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg zui大劑量
I:lg(zui大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應(yīng)率之和
Pm:zui大陽性反應(yīng)率
Pn:zui小陽性反應(yīng)率