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色譜法的基本原理
色譜法的基本原理：
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相;移動的一相稱流動相。
分類：
根據兩相的物態類型，有液-固色譜和液-液色譜兩類基本色譜方法。
液-固色譜的固定相是粉末狀或顆粒狀固體，具有表面吸附活性，流動相是液體。混合物中各組分在固定相表面上的吸附強度不同，當流動相流過時各組分隨流動相的移動速度不同而實現分離。柱色譜、薄層色譜大都屬于這類色譜。
液-液色譜的固定相是附著于載體的液層，流動相是另一種液體。混合物中各組分在兩液相間的分配系數不同，則在兩液相中的濃度不同，隨流動相移動的速度也不同，從而實現分離。紙色譜和有些薄層色譜屬于這類色譜。
一、液-固色譜原理
液-固色譜是基于吸附和溶解性質的分離技術，柱色譜屬于液-固吸附色譜。
當混合物溶液加在固定相上，固體表面借各種分子間力(包括范德華力和氫鍵)作用于混合物中各組分，以不同的作用強度被吸附在固體表面。
柱色譜分離原理
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由于吸附劑對各組分的吸附能力不同，當流動相流過固體表面時，混合物各組分在液-固兩相間分配。吸附牢固的組分在流動相分配少，吸附弱的組分在流動相分配多。流動相流過時各組分會以不同的速率向下移動，吸附弱的組分以較快的速率向下移動。隨著流動相的移動，在新接觸的固定相表面上又依這種吸附-溶解過程進行新的分配，新鮮流動相流過已趨平衡的固定相表面時也重復這一過程，結果是吸附弱的組分隨著流動相移動在前面，吸附強的組分移動在后面，吸附特別強的組分甚至會不隨流動相移動，各種化合物在色譜柱中形成帶狀分布，實現混合物的分離。
二、柱色譜分離條件
氧化鋁對有機物的作用類型
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⑴ 固定相選擇
柱色譜使用的固定相材料又稱吸附劑。
吸附劑對有機物的吸附作用有多種形式。以氧化鋁作為固定相時，非極性或弱極性有機物只有范德華力與固定相作用，吸附較弱;極性有機物同固定相之間可能有偶極力或氫鍵作用，有時還有成鹽作用。這些作用的強度依次為：
成鹽作用 > 配位作用 > 氫鍵作用 > 偶極作用 > 范德華力作用。 有機物的極性越強，在氧化鋁上的吸附越強。
表1：各種吸附劑對于極性有機物的吸附作用強度
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常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、活性炭等(表1)。
色譜用的氧化鋁可分酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁pH約為4-4.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質;中性氧化鋁pH值為7.5，用于分離中性物質，應用zui廣;堿性氧化鋁pH為9-10，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等。
吸附劑的活性與其含水量有關。含水量越低，活性越高。脫水的中性氧化鋁稱為活性氧化鋁。
硅膠是中性的吸附劑，可用于分離各種有機物，是應用的固定相材料之一。
活性炭常用于分離極性較弱或非極性有機物。
吸附劑的粒度越小，比表面越大，分離效果越明顯，但流動相流過越慢，有時會產生分離帶的在重疊，適得其反。
⑵ 流動相選擇
色譜分離使用的流動相又稱展開劑 。
展開劑對于選定了固定相的色譜分離有重要的影響。
各種展開劑對極性有機物的溶解能力
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在色譜分離過程中混合物中各組分在吸附劑和展開劑之間發生吸附-溶 解分配，強極性展開劑對極性大的有機物溶解的多，弱極性或非極性展開劑對極性小的有機物溶解的多，隨展開劑的流過不同極性的有機物以不同的次序形成分離帶。
在氧化鋁柱中，選擇適當極性的展開劑能使各種有機物按先弱后強的極性順序形成分離帶，流出色柱。
當一種溶劑不能實現很好的分離時，選擇使用不同極性的溶劑分級洗脫。 如一種溶劑作為展開劑只洗脫了混合物中一種化合物，對其它組分不能展開洗脫，需換一種極性更大的溶劑進行第二次洗脫。這樣分次用不同的展開劑可以將各組分分離。
一、薄層色譜概念 zui常用的薄層色譜也屬于液-固吸附色譜。同柱色譜不同的是吸附劑被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂層。干燥后在涂層的一端點樣，豎直放入一個盛有少量展開劑的的有蓋容器中。展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細作用向上移動。與柱色譜過程相同，經過在吸附劑和展開劑之間的多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點，實現混合物的分離。
薄層色譜原理圖
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除了固定相的形狀和展開劑的移動方向不同以外，薄層色譜和柱色譜在分離原理上基本相同。由于薄層色譜操作簡單，試樣和展開劑用量少，展開速度快，所以經常被用于探索柱色譜分離條件和監測柱色譜過程。
二、薄層色譜條件
⑴固定相選擇
柱色譜中提到的吸附劑都可以用作為薄層色譜的固定相，分離性能及使用選擇同柱色譜的選擇原則相同(各種吸附劑見柱色譜表1)。
一般用于薄層色譜時，要求吸附劑的粒度更小。商品吸附劑區分為色譜級(用于柱色譜)和薄層色譜級(用于薄層色譜)。
⑵展開劑選擇
薄層色譜展開劑的選擇和柱色譜一樣，主要根據樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。展開劑的極性越大，對化合物的洗脫力也越大。(各種溶劑極性見柱色譜表2)。
選擇展開劑時，除參照表列溶劑極性來選擇外，更多地采用試驗的方法，在一塊薄層板上進行試驗：
①若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強;
②若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上，此溶劑的極性過弱。
當一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。合適的混合展開劑常需多次仔細選擇才能確定。
⑶相對移動值 從點樣原點開始到展開后的溶劑前沿，是溶劑的移動距離，記為lo，混合物中各組分的移動距離分別記為l1，l2，l3 …(移動值示意圖)。
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移動值示意圖
在不同的展開條件下，各化合物的移動距離不會相同，而在同一條件下，相對于展開劑的移動距離，各化合物有可比較的展開數據，稱為相對移動值，或比移值：
Rf=li/lo
在相同條件下測得的比移值可以用于化合物的薄層色譜特征值進行比較對照。
⑷顯色
分離的化合物若有顏色，很容易識別出來各個樣點。但多數情況下化合物沒有顏色，要識別樣點，必須使樣點顯色。通用的顯色方法有碘蒸氣顯色和紫外線顯色。
①碘蒸氣顯色：將展開的薄層板揮發干展開劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產生的碘蒸氣能與有機物分子形成有色的締合物，完成顯色。
②紫外線顯色：用摻有熒光劑的固定相材料(如硅膠F，氧化鋁F等)制板，展開后在用紫外線照射展開的干燥薄層板，板上的有機物會吸收紫外線，在板上出現相應的色點，可以被觀察到。
有時對于特殊有機物使用的顯色劑顯色。此時常用盛有顯色劑溶液的噴霧器噴板顯色。
三、薄層色譜操作 (見 視頻“色譜裝置與操作”)
⑴制板(以硅膠板為例)
選擇合適的玻璃板(經常使用顯微鏡上的載玻片)，依次用水和乙醇洗凈，晾干。取適量薄層色譜用的硅膠，加適量蒸餾水調成糊。調制時慢慢攪拌，勿使產生氣泡。將糊倒在玻璃板上，搖動攤平，晾干。使用前放入烘箱內，在105-115oC左右烘干40-50分鐘。冷卻后使用。
⑵點樣
將試樣用zui少量展開劑溶解，用毛細管蘸取試樣溶液，在薄層板上點樣。在樣點上輕輕畫出一條平行于玻璃板底邊的細線。薄層色譜板載樣量有限，勿使點樣量過多。
⑶展開
吹干樣點，豎直放入盛有展開劑的有蓋展開瓶中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點。蓋上蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度(由試驗確定適當的展開高度)，取出薄層板，再畫出展開劑的前沿線。
⑷顯色，計算Rf值
揮發干展開劑，選擇合適的顯色方法顯色。量出展開劑和各組分的移動距離，計算各組分的相對移動值。
四、薄層色譜應用
⑴可用于判斷兩個化合物是否相同(同一展開條件下是否有相同的移動值);
⑵可用于確定混合物中含有的組分數;
⑶可用于為柱色譜選擇合適的展開劑，監視柱色譜分離狀況和效果;
⑷可用于檢測反應過程。
紙色譜屬于液一液分配色譜。
紙色譜使用的濾紙是載體，附著在紙上的水是固定相。樣品溶液點在紙上，作為展開劑的有機溶劑自下而上移動，樣品混合物中各組分在水-有機溶劑兩相發生溶解分配，并隨有機溶劑的移動而展開，達到分離的目的。
選擇紙色譜條件主要是選擇合適的展開劑。
合適的展開劑一般有一定的極性，但難溶于水。在有機溶劑和水兩相間，不同的有機物會有不同的分配性質。水溶性大或能形成氫鍵的化合物，在水相中分配得多，在有機相中分配少;極性弱的化合物在有機相中分配多。展開劑劑借毛細管的作用沿濾紙上行時，帶著樣品中的各組分以不同的速度向上移動。水溶性大或能形成氫鍵的化合物移動得較慢，極性弱的化合物移動得較快。隨展開劑的不斷上移，混合物中各組分在兩相之間反復進行分配，從而把各組分分開(溶劑極性選擇見柱色譜表2)。
紙色譜在糖類化合物、氨基酸和蛋白質、天然色素等有一定親水性的化合物的分離中有廣泛的應用。
紙色譜的操作與薄層色譜很相似，只是紙色譜的載樣量比薄層色譜更小些。