關鍵詞:基于慢病毒載體的miRNA載體構建|實驗技術服務
簡介：世界*品牌基于慢病毒載體的miRNA載體構建|實驗技術服務原裝，質量保證,*。
基于慢病毒載體的miRNA載體構建|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌：   http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程：
慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。
miRNA是一種21－25nt長的單鏈小分子RNA, 是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性.而且這種特異性和時序性，決定了組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中起多種作用，因此miRNA的研究受到了生物學家的廣泛關注。 
本中心可以將客戶研究的miRNA構建到慢病毒載體，生產的病毒顆粒可以直接用于感染細胞或者動物實驗。可以選擇將Pri-miRNA或者PremiRNA構建到載體，構建中也可以根據實驗需要選用不同的Flank.
特點：
1．可以穩定長期的表達miRNA，可以用于篩選穩定細胞模型用于長期的研究和觀察。 
2．感染效率高而且可以感染絕大部分細胞種類。 
3．可以直接用于動物實驗或者感染細胞后回輸到動物體內。
1.將actin基因，放入慢病毒融合表達載體，與熒光蛋白（GFP）融合表達，注意避免移碼突變。
2.然后將重組質粒以及輔助質粒共轉染細胞，可以用脂質體法，慢病毒配套細胞一般為293。
3.收集慢病毒，濃縮。
4.用慢病毒轉染原代細胞。做好先做預實驗。
5.重組蛋白（例如，GFP-actin）在細胞內表達后，自然的混入細胞骨架中，將之標記綠色熒光。
（一） 實驗流程（1和2為并列步驟）
1.慢病毒過表達質粒載體的構建
設計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶，3K內突變率為0%)從模板中（CDNA質粒或者文庫）調取目的基因CDS區（coding sequence）連入T載體。將CDS區從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質粒載體。
2.慢病毒干擾質粒載體的構建
合成siRNA對應的DNA頸環結構，退火后連入慢病毒干擾質粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h 更換為*培養基，培養24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實驗材料
2.1慢病毒載體、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統為三質粒系統，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）。