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技術文章

PMA 465nm光解光源用于活細菌的篩選

點擊次數:1539 發布時間:2023-1-9

  弧菌(vibrio)是水產品中為常見的致病菌,副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是我國主要水產源致病菌,由該菌引起的食物中毒事件居細菌性食物中毒事件,同時也被視為范圍內導致腹瀉類疾病的為主要因素之一。霍亂弧菌(vibrio cholerae)是導致人體產生霍亂疾病的主要源頭,流行廣泛且屬于烈性傳染病之一,曾多次引起大面積的疾病,主要表現為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水,嚴重的可導致死亡,如何快速、精準和高效地檢測水產品中致病弧菌具有重要意義。

傳統定量檢測食品中副溶血性弧菌和霍亂弧菌的方法通常需要1周時間,基于dna的 qpcr定量技術雖簡便快捷,但無法區分樣品中死菌和活菌,容易導致假陽性現象。光敏型核酸染料疊氮溴化丙錠(pma)與qpcr技術相結合,可以選擇性地識別水產品中的活菌dna,可用于進行活菌定量檢測。pma前處理包括暗處理和光交聯兩個關鍵步驟,傳統的 pma前處理方法通常在一個密閉的環境進行暗處理,手持600w左右的鈉鎢燈進行光交聯,過程繁瑣,全程人工操作費時耗力;基于藍光led管的光交聯儀器LUYOR-3419PMA光解儀可大大簡化pma前處理過程。

實時熒光定量PCR 即qPCR 技術作為特定核酸片段走量的金標準,是目前應用為廣泛和有效的核酸分子走量手段。考慮到細菌數量和其含有的特定核酸分子(如16S rDNA)里正比例關系,因此qPCR 技術也被用于細菌定量檢測領域中o 然而在實際的微生物生態體系中,有活細菌也存在著死細菌;死細菌雖然己經死亡,但其DNA 會在較長時間內存在,因此采用qPCR 定量反映的是某種菌總菌的結果。對于微生物體系的解析尤其涉及生態功能的分析, ~t 細菌的數目更加能反映該種菌在生態體系中發揮的實際影響和作用,因此如何排除死細菌的干擾準確定量活細菌變得十分重要,由此催生了PMA-qPCR 等活細菌的定量分析技術。

疊氮澳化丙鏈(Propidium Monoazide , PMA) 是一種對核酸具有高度親和力的光敏染料,由于不能透過完整的細胞膜, PMA 只能修飾細菌死亡后暴露出來的DNA 分子。用合適濃度的PMA 處理的細菌樣品暴露于強光下時, PMA 所帶的光敏性疊氨基團轉化為高潔性的氮賓自由基,并與結合位點附近的任意碳氫化合物反應形成穩定的共價氮碳鍵。這樣使得死細菌的DNA 獲得修飾,導致其DNA 分子的qPCR 擴增被阻斷;而活細菌則不受影響。相關研究表明, PMA 與qPCR 技術結合后可有效的抑制死細菌DNA 的擴增,因此PMA-qPCR 技術是一種能有效用于細菌活細胞定量檢測的分子手段,現在被廣泛應用于致病菌或有害菌活菌的定量檢測等領域中。

PMA 對死細菌DNA 的共價結合效率受到多種因素的影響,主要因素有細菌種類、菌液濃度、PMA 濃度和曝光時間等。PMA 濃度和曝光時間的選擇在于:PMA 濃度過低或曝光時間過短則不能充分結合和修飾死細菌的DNA; 而PMA 濃度高到一定程度則會有不容忽視數量的PMA 分子滲透進活細菌細胞內,長的曝光時間將增強其對活菌DNA 的結合和修飾作用。因此采用PMA-qPCR 對某一研究體系中特定活細菌進行走量檢測時,往往先在固定的純菌濃度下探究佳的PMA 處理濃度和曝光時間,之后用于實際從而達到更高的準確率。

PMA -qPCR ~t菌檢測方法的建立與應用

(1)制備細菌懸液:培養好純菌后,適當稀釋到一定濃度(如OD600=1,即經過稀釋使得在600nm 下的吸光值為1),取若干份等體積的菌,其中一半采用加熱和超聲處理結合制備死菌樣品,而另外一半不做處理為活菌樣品; 

(2) PMA 處理:在不同的PMA 濃度和曝光時間下處理(1)中的活菌組和死菌組樣品; 

(3) qPCR 擴增和數據分析:提取(2) 中經PMA 處理的樣品的基因組DNA ,以此為模板采用該細菌特異性的qPCR 引物進行擴增,得到各組的Ct 值(qPCR 熒光闊值同擴增曲線交點對應的循環數)綜合分析選出佳的PMA 處理條件。低的PMA 濃度和曝光時間為死細菌組Ct 值穩定時(即不隨PMA 濃度和曝光時間的增加而發生顯著的增高,如Ct 值增量不超過1)的處理濃度和時間,高的PMA 濃度和曝光時間為活細菌Ct 穩定時的處理濃度和時間;而佳的PMA 處理條件則在高和低的PMA 濃度和曝光時間之間的實際處理條件中擇優選定,這樣在保證充分抑制死細菌DNA 擴增的同時又不會影響到活細菌DNA 的擴增。

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