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一般，在二氧化碳培養箱內細胞沒有污染的情況下平均1-3個月消毒一次。常用的3種消毒滅菌的方式是：液體消毒劑、紫外和干熱。
1、液體消毒劑：選擇對二氧化碳培養箱無腐蝕性的液體消毒劑，并且液體消毒劑的消毒效果好壞和很多因素有關。比如：場所的溫度、接觸時間、pH、穿透能力、有機物的反應。這些因素中的一些很小的變化可能會造成去污劑的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情況下，當最終要求必須無菌時，液體去污劑也不是可信賴的去污方法。
2、 紫外消毒：一般先用蒸餾水清洗干凈后，再用培養箱自帶的紫外燈照射一天。當紫外燈在有遮光罩的情況下照射時，紫外線照射到腔體的次數很少。
3、 干熱滅菌：當CO2培養箱用于污染危險區域時，干熱滅菌可作為清潔室內的附加手段。干熱滅菌采用6面直接加熱，加熱溫度高達125°C。這使得腔體能夠破壞細菌。高溫（125°C）在培養箱中保持2小時以上。經過8小時的滅菌程序（包括2-3小時的預熱時間，具體情況取決于溫度），滅菌室內的溫度降低并恢復到37°C或上一個程序設定的溫度。除了以上幾種方法外，還可以采用聯合殺菌的方法，幾種消毒滅菌的方法同時使用來達到清潔的效果。
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