 | 重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司 |
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細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)技術(shù)）
閱讀：1760發(fā)布時(shí)間：2014-3-3
根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代。
實(shí)驗(yàn)方法原理
培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。
實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞 、試劑、試劑盒 、D-Hanks液 、小牛血清、 RPMI1640 、雙抗 、胰蛋白酶 、EDTA 、NHCl 、NaHCO3
儀器、耗材
凈化工作臺(tái) 、離心機(jī)、 恒溫水浴箱、 冰箱、 倒置相差顯微鏡、 培養(yǎng)箱、 吸管、 玻璃瓶、 培養(yǎng)瓶、 廢液缸、 吸頭、 槍頭 、膠塞 、離心管 、量加樣槍、 紅血球計(jì)數(shù)板
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 貼壁細(xì)胞的消化法傳代：
（1）吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
（2）D-Hanks液洗2～3次。
（3）向瓶?jī)?nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。
（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動(dòng)再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化（也可不采用上述步驟直接加消化液進(jìn)行消化）。
（5）消化在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進(jìn)行。
（6）消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。
（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉。
（8）再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。
（9）用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過(guò)程要順序進(jìn)行。
（10）從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛。
（11）計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
2. 懸浮細(xì)胞的傳代：懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。
離心傳代法：
（1）將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。
（2）離心800~1000 rpm，5 min。
（3）棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。
（4）計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
（5）直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。
3. 部分貼壁細(xì)胞的傳代
（1）部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。
（2）對(duì)絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。
注意事項(xiàng)
1. 胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜℃。
2. 離心轉(zhuǎn)速要合適，轉(zhuǎn)速過(guò)低，不能有效分離細(xì)胞，離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。
3. 要定時(shí)觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時(shí)處理。
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