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深入了解重組白蛋白純化：質量、產量與成本的平衡藝術
人血清白蛋白(HSA)在生物制藥行業有著廣泛的應用，包括血漿擴增、配方賦形劑、藥物輸送、傷口愈合以及作為融合搭檔延長蛋白質藥物的半衰期。由于人血清白蛋白的供應有限，無法滿足臨床需求，因此科研人員正在尋找其他來源的白蛋白，例如通過基因工程生產重組人血清白蛋白，以及各種各樣的白蛋白融合蛋白已經被生產出來，以延長融合蛋白的循環半衰期，同時保持其活性。
目前，重組白蛋白的生產主要依賴于基因工程方法，通過酵母、CHO細胞或大腸桿菌等表達系統表達目標蛋白，再進行分離純化等工藝。然而，在表達和純化過程中，存在一些技術難題，如表達水平低、翻譯后修飾不完quan、純化步驟繁瑣且收率低等。
為了解決重組白蛋白融合蛋白純化步驟繁瑣且收率低的問題，Astrea Bioseparations與Albumedix【重組白蛋白產品的生產商和白蛋白融合蛋白技術的開發商(Veltis®)】合作開發了AlbuPure®，一種高度穩定、穩健、無毒、具有高結合能力、高回收率和高純度的親和色譜。符合ISO 9001質量標準的生產環境，可用于白蛋白及白蛋白融合蛋白的純化和cGMP生產。
AlbuPure®是一種新型合成三嗪配基，源自Astrea Bioseparations的“Mimetic Ligand™ "技術，并與其專li PuraBead®6HF瓊脂糖基質偶聯。該技術提供了穩定的基架和配體，可以使用1 M NaOH進行清潔，壽命較長。
AlbuPure®性能：
| Ligand: | Synthetic triazine |
| Adsorbent appearance: | White |
| Mean particle size: | 90±10um |
| Base matrix: | Highly cross-linked 6% near-monodisperse beaded agarose (PuraBead® 6HF) |
| Binding capacity: | >35 g/L* |
| Operational flow rate: | Up to 600 cm/hr |
| Packing conditions: | Saline solution at a constant pressure of 1.5 bar (~22 psi) |
| Chemical stability: | Stable in all commonly used buffers and solutions |
| Sanitization: | 0.5 to 1.0 M NaOH, 25℃ |
| Storage: | 2-30℃, 20% ethanol / 80% 0.1 M NaCl (v/v) |
| *Performed using scFv albumin fusion fermentation supernatant loading to 10% breakthrough at 240 cm/hr, pH 4.5 | |
AlbuPure®捕獲和純化重組白蛋白融合蛋白案例分享：
材料與方法
使用AlbuPure®在自動色譜工作站上純化Albumedix酵母表達系統生產的不同白蛋白融合蛋白IL-1ra和anti-HIV gp41，在上樣前都經過預處理。
未結合蛋白和結合不緊密的蛋白通過平衡緩沖液去除。結合的非靶標蛋白隨后使用一系列增加pH的緩沖液洗脫。白蛋白融合蛋白使用含有辛酸鈉的緩沖液選擇性地洗脫。
表1:使用AlbuPure®從CCS中捕獲純化IL-1ra和anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白并去除宿主細胞蛋白(HCP)的色譜條件。 
*白蛋白融合蛋白-基因融合:
(1) IL-1ra - 18 kDa(大分子量)
(2) gp41 - 5 kDa(小分子量)
用稀乙酸調節得到pH為5.3的樣品，電導率為~ 3mS /cm。
結果與討論
一、IL-1ra白蛋白融合蛋白
IL-1ra 白蛋白融合蛋白 （~85 kDa） 被 AlbuPure® 吸附劑捕獲，非靶標蛋白在色譜柱中流穿。使用一系列pH值增加的緩沖液洗滌去除宿主細胞蛋白，之后使用含有辛酸鈉的緩沖液選擇性地從柱中洗脫白蛋白融合蛋白(圖1)。通過SDS-PAGE分析工藝餾分(圖2)。
圖1:利用AlbuPure®從CCS中捕獲和純化IL-1ra白蛋白融合蛋白、去除HCP的色譜圖。
圖 2: 使用 AlbuPure® 純化的 CCS 中 IL-1ra 白蛋白融合蛋白層析組分的SDS-PAGE. Lane 1: Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg).
SDS-PAGE 分析（圖 2）表明目標蛋白較高的結合能力，非目標蛋白在流穿液和洗滌液中（lanes 2 and 3）。增加 pH 值的洗滌步驟（lanes 4 to 6）突出表明非目標蛋白大量被清除（只有少量目標蛋白流失）。洗脫部分顯示出較高的IL-1ra 白蛋白融合蛋白的純度和回收率（lanes 7 and 8）。
二、anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白
使用 AlbuPure® 捕獲并純化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白（~72 kDa）,非靶標蛋白在色譜柱中流穿。使用一系列pH值增加的緩沖液洗滌去除宿主細胞蛋白(HCP)。gp41白蛋白融合蛋白選擇性用辛酸鈉從柱中洗脫（圖3）;過程餾分通過SDS-PAGE進行分析（圖 4）。
圖3:使用AlbuPure®從CCS中捕獲和純化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白的色譜圖
SDS-PAGE分析(圖4)表明目標蛋白較高的結合能力，非目標蛋白在流穿液和洗滌液中(lanes 2 and 3)。增加 pH 值的洗滌步驟（lanes 4 to 6）突出表明非目標蛋白大量被清除（只有少量目標蛋白流失）。洗脫部分顯示出較高的anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白的純度和回收率（lanes 7 and 8）。
圖 4: 使用 AlbuPure® 純化的 CCS 中anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白層析組分的 SDS-PAGE。 Lane: 1. Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg)
總結
AlbuPure®可用于從發酵和細胞培養上清液中捕獲和純化重組白蛋白融合蛋白，如本案例所示，具有高純度和回收率。
AlbuPure®吸附劑已被用于純化各種分子量的白蛋白融合蛋白：
| Fusion partner | Approximate fusion partner MW |
| HIV peptides | 5kDa |
| IL-1ra | 18kDa |
| Endostatin | 20kDa |
| Prosaptide | 2.5kDa |
| Kunits Domain | 7kDa |
| scFv | 30kDa |
| dAb | 13kDa |
| Nanobody | 14kDa |
| vNAR | 13kDa |
此外，AlbuPure®能夠以高達600厘米/小時的流速處理復雜的原料。因此，AlbuPure吸附劑可以通過縮短處理時間來顯著降低制造成本，它具有高操作流速和高結合能力，以及重復再生使用的性能。
參考資料
Data courtesy of Albumedix Ltd: Use of a Novel Affinity Matrix as a Platform Purification for Albumin Fusions, Recovery of Biological Products XIV Conference presentation, Lake Tahoe, California, August 1st – 6th 2010.
產品信息：
| 貨號 | 品名 | 規格 | 品牌 |
| 3151-00025 | AlbuPure® (25 mL) | 25mL | Astrea |
| 3151-00100 | AlbuPure (100 mL) | 100mL | Astrea |
| 3151-00500 | AlbuPure (500 mL) | 500mL | Astrea |
| 3151-01000 | AlbuPure (1 L) | 1L | Astrea |
| 6626 | AlbuPure® 4 x 1 mL | 4x1mL | Astrea |
| 6627 | AlbuPure® 4 x 5 mL | 4x5mL | Astrea |
英國Astrea Bioseparations于1987年成立，公司前身是Affinity Chromoatography Ltd，其從英國劍橋大學獨立出來專注于吸附填料的研發和生產。Astrea Bioseparations 公司兩大核心專li技術（產品）Mimetic ligand® 和PuraBead® 是公司產品的基石，迄今為止已有22個上市產品（FDA/EMA） 使用 Astrea Bioseparations公司的產品用于商業化生產，其中不乏跨國公司和新興生物技術公司。
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