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細胞染色專題——熒光染料選擇指南

閱讀：692 發布時間：2023-4-24

細胞培養后，需要對其生長情況、形態甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當的手段，難以觀察其形態、結構，更難發現細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。今天小愛就為大家整理了幾種常用細胞染色方法及染色劑選擇指南，快來學習！

表1 幾種常用細胞染色方法及特點

染色方法	染色特點及應用范圍
革蘭氏染色法	一種重要的細菌鑒別染色法，經染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，從而用以分類鑒定。
瑞氏染色法	瑞氏試劑中酸性伊紅和堿性美藍混合經化學作用后，變成中性的伊紅化美藍，久置后，經氧化而含有天青。此三種染料分別和細胞中的NH3+和COO-等結合，使細胞核及胞漿著色。由于系中性染料，又有緩沖液調節酸堿度，所以細胞受染后，藍紅等顏色都較適中，核染質、胞漿以及其中顆粒顯色較為清楚。
姬姆薩染色法	病理學以及疾病研究中常用的染色劑。染色原理和結果與瑞氏染色法基本相同。但該法對細胞核和寄生蟲著色較好，結構顯示更清晰，而細胞質和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復合染色法。
免疫組化染色法	利用抗原抗體之間的特異性結合，用于研究細胞產物如分子、蛋白質或糖蛋白的表達、定位、分布和遷移等。

了解細胞染色方法后，下面小愛向大家介紹研究不同細胞結構用到的熒光染料。

一、細胞膜常用染料

DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態學和結構研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側向擴散，在最佳濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究，如Treg細胞、間充質干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。

表2 細胞膜常用染料及熒光顏色

貨號	產品名稱	熒光顏色	λEx(nm)/ λEm (nm)
abs47048165	DiD 對氯苯磺酸鹽	紅色	644/663
abs45153692	DiR 碘化物	深紅色	748/780
abs45153674	DiO 高氯酸鹽	綠色	484/501
abs42002237	DiI 高氯酸鹽	橙色	549/565

二、其他細胞結構常用染料

生物染料在細胞結構和組分鑒定中有著廣泛的應用，除細胞膜研究外，我們經常也會對一些其它細胞結構及成分進行探索，例如線粒體、溶酶體、蛋白質、細胞核等，而對于不同的細胞結構有不同的染料進行染色，小愛總結如下：

表3常用細胞染料及用途

貨號	產品名稱	產品用途
abs47047616	DAPI染色液	細胞和組織細胞核染色。
abs47048270	TRITC- Phalloidin	選擇性結合絲狀肌動蛋白F-actin，用于細胞骨架研究。
abs47047622	臺盼藍染色液(0.4%)	常用于檢測細胞膜完整性和細胞存活率。
abs47047618	姬姆薩染液	用于染色體、血液、組織切片、原生動物寄生蟲等。
abs47047620	Hoechst 33342	標記DNA，也用于細胞核和線粒體的顯像觀察。
abs47047744	JC-10	可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。
abs47014951	吖啶橙鹽酸鹽	細胞周期研究，細胞培養物和組織模型的凋亡研究。也能用作溶酶體染料，但缺乏特異性。
abs42023979	(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯	在溫和條件下標記蛋白質、肽、細胞器、抗體、寡核苷酸和微珠。

三、細胞染色神器DAPI + Phalloidin

DAPI染色液(DAPI Staining Solution)常用于細胞核染色，可將細胞核染成藍色。鬼筆環肽（Phalloidin）是細胞骨架的染色神器，羅丹明標記的Phalloidin（TRITC- Phalloidin）可將細胞染成橙紅色，DAPI與Phalloidin染色液是研究細胞形態變化時經常用到的兩種共染的試劑，染色效果可見圖1[1]：A1-E1用TRITC-鬼筆環肽（橙紅）染色的細胞骨架免疫熒光圖；A2-E2用DAPI（藍色）染色的細胞核免疫熒光圖；A3-E3合并的L929細胞免疫熒光染色圖。圖2[2]是S100A16過表達或下調前后PDAC細胞形態的變化。

圖1 P34HB纖維支架敷料培養的L929的細胞毒性評估[1]。

圖2 試劑處理后PDAC細胞形態變化[2]。

注意事項：

1.熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。2、避免反復凍融，否則容易失效。3、DAPI對人體有刺激性，注意適當防護。4、鬼筆環肽具有毒性，需小心操作（對人的半數致死劑量 LD50 約 2mg/kg）。

細胞染色專題---熒光染料選擇指南

參考文獻：

[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.

[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.

常見問題解答（FAQ）

Question	Answer
Q1：用DAPI和鬼筆環肽染細胞的先后順序是什么？	一般情況下先用鬼筆環肽對細胞骨架進行染色20~40分鐘，PBS清洗細胞2次，再用DAPI復染10~20分鐘。可根據實際染色情況縮短或延長時間。
Q2：用DAPI染細胞核時，整張圖片顯示藍色是什么原因？	染色時應注意滴加量不要太多，否則會造成整張圖像呈現藍色背景，只需覆蓋上薄薄的一層即可。此外，熒光染料存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。
Q3：DAPI染色中避光的操作到底要多嚴格才不至于影響結果？	DAPI相對很容易染上色，避光處理時加樣等操作短時見光沒有關系，但是不操作的時候需要暗盒或錫紙包裹，染色后應盡快檢測。
Q4：我的細胞樣品轉染了帶有GFP的質粒，應該選擇哪種鬼筆環肽？	可以選擇TRITC（橙紅）或是Fluor 700（遠紅）標記的鬼筆環肽。
Q5：鬼筆環肽有好多種，它們的區別是什么？我應該如何選擇？	主要是熒光基團的差異，激發不同的熒光顏色，用來區分共染時其他熒光染料的顏色，選擇時應滿足機器激發和發射波長。
Q6：鬼筆環肽可以染活細胞嗎？什么染色劑可以染活細胞？	鬼筆環肽不能直接應用于活細胞的染色，因為它無法穿越細胞膜。DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。