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質粒轉染的技巧
閱讀：1327 發布時間：2023-1-5
一、質粒轉染原理以及應用
質粒轉染是指利用不同的載體物質攜帶質粒DNA通過直接穿膜或膜融合的方法將外源DNA分子導入真核細胞，使外源基因表達，從而針對某個基因和蛋白質的功能進行一系列生物學功能研究的方法。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷深入，DNA轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規實驗工具。質粒轉染在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生命科學前沿研究中，應用越來越廣泛。
二、質粒DNA轉染方法
質粒DNA導入細胞有多種方法，包括物理介導（電穿孔法、顯微注射和基因槍）、化學介導（磷酸鈣共沉淀法、載體轉染法等）和生物介導（原生質體轉染、病毒介導的轉染）三類途徑。這三類技術中，又以載體轉染法最為常用。國際上應用較早的轉染載體多為脂質體類載體，但此類轉染載體細胞毒性較大，轉染效率往往也不夠理想。近年類，納米生物材料類載體的應用逐漸增多，此類載體最大的優點是細胞毒性較低，部分品牌載體的轉染效率也顯著優于脂質體類載體。
三、如何選擇DNA轉染試劑
顯然，質粒轉染能否成功的關鍵在于質粒轉染試劑的選擇，目前常用的DNA轉染試劑有RFect系列質粒DNA轉染試劑、Lipo2000等。如何選擇合適的質粒DNA轉染試劑，一般可從以下幾個方面考慮：
1.對質粒DNA有較高的轉染效率。
轉染效率的確定，常用的是使用熒光定量PCR、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測等方法。金標準無疑是檢測目標基因的mRNA水平，因為轉染試劑不僅要把質粒DNA轉染進入細胞，還應及時把轉入細胞的DNA釋放出來，發揮基因表達或基因調控的作用。通過熒光顯微鏡判斷轉染效率至少存在兩方面的問題：1、熒光顯微鏡看到的熒光點可能是非特異吸附的結果；2、有些轉染試劑能夠將質粒DNA轉染入細胞，但不能充分釋放，導致基因表達或基因調控效率并不高。因而，判斷轉染試劑轉染效率的金標準應該是熒光定量檢測mRNA水平，僅靠觀察熒光顯微鏡判斷轉染效率、選擇轉染試劑往往會導致誤判，影響實驗的進展。
目前國內應用的轉染試劑有RFect系列質粒DNA轉染試劑、Lipo2000等。其中，Lipo2000為脂質體類轉染試劑，RFect系列質粒DNA轉染試劑為生物納米材料類轉染試劑，是近幾年應用較廣的轉染試劑。RFect質粒DNA轉染試劑雖在國內生產，但實際上也是在美國研發成功。就轉染效率而言，RFect質粒DNA轉染試劑對絕大多數貼壁細胞的轉染效率可高達90%以上（EGFP質粒），另外，RFectSP懸浮細胞質粒DNA轉染試劑專門針對懸浮細胞的質粒DNA轉染，轉染效率在大部分懸浮細胞中高達70%以上。與之相比，Lipo2000對大多數貼壁細胞的轉染效率一般為75%左右，對有些原代細胞以及懸浮細胞根本無法做到有效轉染。顯然，從轉染效率上說，RFect系列質粒DNA轉染試劑更具優勢。
2.對轉染細胞的毒性很小。
轉染試劑如果毒性過大，會導致大量細胞死亡，這會直接影響對轉染試驗結果的判讀和解析。脂質體類轉染試劑本身會導致某些基因的表達改變，因而會影響轉染試驗結果的客觀性。以上可見，應盡量選擇毒性較小的轉染試劑。
有些研究者對細胞毒性不太重視，僅僅考慮是否可將質粒DNA轉染進入細胞，其結果在某些高水平的期刊，往往會導致審評的質疑。對于國內常見的幾種轉染試劑來說，RFect系列質粒DNA轉染試劑主要由生物納米材料制成，細胞毒性較低，轉染細胞死亡率不到10%。Lipo2000屬于脂質體類轉染試劑，具有脂質體類轉染載體固有的細胞毒性，細胞毒性往往較高，轉染細胞死亡率有時在30%以上。
3.轉染細胞的種類。
目前常見的轉染試劑包括RFect、Lipo2000及國內其它廠家的產品，主要轉染對象為貼壁培養細胞，對懸浮細胞和原代細胞的轉染效率都不是非常理想。Lipo2000對原代和懸浮細胞基本上無法做到有效轉染，而且因為原代細胞較馴化的細胞株敏感性更高，Lipo2000轉染后的死亡率也很高。RFect系列質粒DNA轉染試劑細胞毒性較低，根據轉染的細胞種類不同，可以選購RFect質粒DNA轉染試劑或者RFectSP懸浮細胞質粒DNA轉染試劑。