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微孔板夾心雜交法工作原理？
閱讀：996 發(fā)布時(shí)間：2022-10-14
ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，其基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。ELISA技術(shù)作為免疫標(biāo)記技術(shù)（包含免疫熒光技術(shù)，免疫放射技術(shù)，免疫酶技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)）中的一種，已廣泛應(yīng)用于科研和臨床實(shí)驗(yàn)中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特點(diǎn)。
在ELISA實(shí)驗(yàn)方法中，比較常見的方法有雙抗體夾心法，競爭法，間接法，雙抗原夾心法，捕獲法，下面對(duì)此一一詳述。
1.雙抗體夾心法
雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，然后加入待檢標(biāo)本，通過加入檢測抗體，酶標(biāo)記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關(guān)。
該方法的適用條件是：含有多個(gè)抗原表位的大分子物質(zhì)。因?yàn)檫@種檢測方法需要兩種抗體，所以就涉及抗體配對(duì)的問題。一般而言，常用的抗體配對(duì)方法有一下幾種：包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對(duì)的抗原表位不同；包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般是來源于不同的宿主。
這種檢測方法在應(yīng)用酶標(biāo)第二抗體時(shí)，應(yīng)該注意的一個(gè)原則是：第二抗體必須只能針對(duì)檢測抗體，而不能針對(duì)包被抗體。鑒于酶標(biāo)二抗的局限性，現(xiàn)在一般廠家都引入生物素親和素放大系統(tǒng)，這種系統(tǒng)在提高反應(yīng)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)用起來也更加方便，我們只需要對(duì)檢測抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，不需要對(duì)每一種不同來源的二抗進(jìn)行酶標(biāo)記，只需對(duì)親和素做HRP標(biāo)記就可以省去很多繁瑣的工作。
2.競爭法
競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進(jìn)行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和生物素標(biāo)記的抗原物質(zhì)進(jìn)行競爭結(jié)合，經(jīng)合適的溫度和一定時(shí)間的孵育，洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行反應(yīng)，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負(fù)相關(guān)。
該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)，當(dāng)然，這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時(shí)，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測抗體時(shí)，可能由于兩種競爭。