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電鏡免疫膠體金―膠體銀染色法 江蘇泰諾源
電鏡膠體金―膠體銀染色(immunogold-sliverstaining)法系20世紀(jì)80年代創(chuàng)立的將免疫金染色和銀顯影2者結(jié)合而形成的一種新型檢測(cè)技術(shù)，可用于電鏡包埋前染色，Ted pella 膠體金和Ted pella膠體銀能*使用需求。
Ted pella 膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其*的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)Ted pella 膠體金在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能使用到。
膠體金―膠體銀染色法基本原理是*行免疫膠體金染色標(biāo)記抗原，使其結(jié)合在組織細(xì)胞抗原所在位置，然后進(jìn)行物理顯影，當(dāng)顯影劑中的對(duì)苯二酚將銀離子還原成銀原子時(shí)，后者將圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”。“銀殼”本身亦具有催化作用，進(jìn)一步促使更多銀離子還原，則使“銀殼”越來越大，抗原位置因此而變得清晰，抗原信號(hào)也得以放大，故此法是zui為敏感的細(xì)胞化學(xué)方法之一。因金顆粒的電子密度高，加之敏感性也高，故特別適合免疫電鏡的抗原研究。
電鏡膠體金―膠體銀染色法主要操作程序如下：
1. 組織固定后，5%、10%和20%系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚10～30gm；
2. 含1%正常羊血清或1%BSA的PBS室溫孵育20分鐘，封閉抗體非特異性結(jié)合部位；
3. 含1%氫硼化鈉的PBS孵育20分鐘；
4. *抗體孵育，可先置4℃，12～18小時(shí)，然后室溫1小時(shí)，使抗體充分滲透并結(jié)合；
5. PBS漂洗3次，每次5分鐘；
6. 0.1% BSA/PBS液(pH 8.2)漂洗5分鐘，為膠體金結(jié)合提供堿性環(huán)境；
7. 膠體金標(biāo)記的第二抗體(pH 8.2)室溫孵育30～45分鐘，需摸索*稀釋度；
8. 硝酸銀液避光處理2―10分鐘，顯影時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定；
溶液配制方法：
硝酸銀液配制：雙蒸水60ml，枸櫞酸緩沖液10ml，對(duì)苯二酚1.0g溶于30ml雙蒸水，將三者混合，*溶解后，用前加入硝酸銀液2.0ml(含35mg硝酸銀)混勻；
枸櫞酸緩沖液的配制：枸櫞酸(C6 H8O-7H2 O)25. 5g，枸櫞酸三鈉(NaC6H5O7 2H2 0)23.5g，用雙蒸水溶解至100ml，即為pH 3.5的枸櫞酸緩沖液。
9. 解剖顯微鏡下選取免疫反應(yīng)陽性部位。1%OsO4后固定30分鐘，雙蒸水漂洗；
10. 組織標(biāo)本的脫水、樹脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。
電鏡膠體金―膠體銀染色法主要優(yōu)點(diǎn)：
該方法形成的金銀顆粒電子密度高，反差強(qiáng)，敏感度高；包埋前染色的標(biāo)本可在解剖顯微鏡下選取陽性部位，結(jié)合半超薄切片的應(yīng)用，能明顯提高工作效率，特別適于抗原含量少的組織細(xì)胞的免疫電鏡研究。缺點(diǎn)：顯影處理需在暗室進(jìn)行，操作較繁瑣；而且增加包埋前免疫染色處理的步驟易導(dǎo)致非特異性著色；另外，單個(gè)金顆粒周圍結(jié)合的銀粒子不甚牢固，漂洗等處理容易脫離，半定量研究時(shí)應(yīng)注意；此外銀等廢液直接流人下水道，容易導(dǎo)致環(huán)境污染。
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