ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測(cè)的方法，主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡(jiǎn)單，整個(gè)測(cè)定過(guò)程中卻有諸多影響因素，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題，我們將常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表：
問(wèn)題一：高背景或陰性對(duì)照值偏高
可能原因 | 建議 |
陰性對(duì)照孔被陽(yáng)性對(duì)照或樣品污染 | 洗滌時(shí)，勿將洗液溢出孔外。 |
洗滌不充分 | 確保在洗滌時(shí)每個(gè)孔都充滿了液體，確保將殘余液體從孔中移除。 |
酶結(jié)合物過(guò)濃 | 請(qǐng)檢查酶結(jié)合物是否按說(shuō)明書(shū)規(guī)定稀釋 |
孵育溫度過(guò)高 | 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 |
底物在使用前曝光 | 應(yīng)保存在暗處，避光。 |
讀板前停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問(wèn)題二：陽(yáng)性對(duì)照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建議 |
蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板。 |
溫度不均勻 | 校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板。 |
問(wèn)題三：邊緣效應(yīng)
可能原因 | 建議 |
蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板 |
溫度不均勻 | 校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板 |
問(wèn)題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
可能原因 | 建議 |
倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻 | 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻 |
過(guò)早稀釋 | 標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋 |
加入的體積不正確 | 使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中 |
問(wèn)題五：標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無(wú)檢測(cè)信號(hào)
可能原因 | 建議 |
樣本中無(wú)檢測(cè)物或檢測(cè)物含量極低 | 設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn) |
樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測(cè) | 作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測(cè)回收率。 |
樣本中檢測(cè)物濃度過(guò)高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值 | 適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測(cè)物濃度盡量在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)。 |
問(wèn)題六：重復(fù)性較差
可能原因 | 建議 |
微孔中有氣泡 | 用針尖挑破氣泡 |
試劑未混勻 | 確保充分混勻試劑 |
樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 | 使用前離心 |
微孔包被面被吸頭劃破 | 加液時(shí)小心操作 |
使用用過(guò)的封板膠紙 | 每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔 |
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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