豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒

（此說(shuō)明書僅供參考，以包裝內(nèi)英文說(shuō)明書為準(zhǔn)！！）

1、疾病概況

PEDV屬于冠狀病毒科，可以使任何年齡段的豬出現(xiàn)嚴(yán)重的小腸炎，初生仔豬容易死亡。這個(gè)病的癥狀與TGEV相似。

在歐洲和中國(guó)已受該病的傳播影響。1969年在歐洲爆發(fā)過(guò)此病毒的大流行。在1969年前，收集的豬血清中沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的抗體。從那時(shí)開(kāi)始，該病已向歐洲多個(gè)國(guó)家蔓延，嚴(yán)重的爆發(fā)則較少發(fā)生。在大型的養(yǎng)殖場(chǎng)里，病毒持續(xù)留在斷奶和失去母源抗體免疫力的仔豬體內(nèi)。在這些場(chǎng)里，病毒可能與斷奶腹瀉有關(guān)。病毒的傳播主要通過(guò)豬的直接接觸傳染和接觸病毒污染物的間接傳染。

PED的研究癥狀包括厭食、嘔吐、腹瀉和脫水。在5日齡以下的感染豬由于發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉和脫水，發(fā)病率和死亡率為100%；而大于10日齡的染病豬的發(fā)病率和死亡率為10%。

該病肉眼可見(jiàn)的病變是小腸邊緣的絨毛變短作為主要特征，與TGE的病變相似。結(jié)腸無(wú)病變。

2、試劑盒的介紹

從生物試劑母豬的初乳中檢測(cè)PED IgA抗體的試驗(yàn)，對(duì)PED的防控有很大的意義。韓國(guó)安捷公司的PED IgA抗體ELISA試劑盒含有已經(jīng)包被好PED IgA抗原的微孔酶標(biāo)板。檢測(cè)時(shí)，包被抗原的酶標(biāo)板與稀釋好的血清孵育，然后與羊抗豬的IgA-HRP酶標(biāo)物反應(yīng)。孵育后，在加入底物前用清洗液將沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)清洗干凈。反應(yīng)結(jié)合的酶跟孔中乳汁的PED IgA抗體的量成正比例。加入終止液結(jié)束反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在456nm和620nm雙波長(zhǎng)條件下，讀取結(jié)果。

3、試劑盒組成

1）抗原包被好的酶標(biāo)板5塊

2）陰性對(duì)照：1ml1瓶

3）陽(yáng)性對(duì)照：1ml1瓶

4）樣品稀釋液：80ml1瓶

5）20倍濃縮的清洗液：250ml1瓶

6）101倍濃縮的酶標(biāo)物：1ml1瓶

7）酶標(biāo)稀釋液：80ml1瓶

8）底物A：40ml1瓶

9）底物B：40ml1瓶

10）終止液：80ml1瓶

11）封板膜10塊

12）說(shuō)明書1份

4、注意事項(xiàng)

為了得到重復(fù)性好的結(jié)果，建議必須遵循以下規(guī)定。

1）只用于體外診斷。

2）不同批號(hào)的試劑不能混合。

3）使用干凈的玻璃器皿，不準(zhǔn)使用生銹的金屬容器。

4）接觸潛在感染物和實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，必須使用一次性手套。

5）使用底物和終止液時(shí)要小心，避免讓液體接觸皮膚、眼睛和粘膜。如果不慎沾上，應(yīng)立即用自來(lái)水沖洗。

5、樣品收集和保存

1）從生物試劑的母豬身上采集乳汁樣本。

2）如果樣本不是馬上進(jìn)行檢測(cè)的，請(qǐng)保存在2~8℃的環(huán)境中。要保存時(shí)間超過(guò)3天的，請(qǐng)將樣品保存在-20℃或更低的溫度環(huán)境中。使用前，請(qǐng)把樣品放到室溫環(huán)境進(jìn)行回溫。

3）出現(xiàn)沉淀物的樣品會(huì)使結(jié)果不一致，該樣品不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

6、試劑的準(zhǔn)備

1）使用前，將試劑盒的所有試劑回復(fù)到室溫。

2）不用稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照液和樣品。

3）準(zhǔn)備酶標(biāo)物（101倍濃縮）：使用前，必須將酶標(biāo)物按1:100進(jìn)行稀釋。（10ul的酶標(biāo)物加入1ml的酶標(biāo)物稀釋液中進(jìn)行稀釋。）

4）清洗液的準(zhǔn)備（20倍濃縮）：使用前，必須將清洗液按1:19進(jìn)行稀釋。如果洗液出現(xiàn)結(jié)晶物，請(qǐng)將洗液放在37℃處，加熱數(shù)分鐘即可溶解結(jié)晶物。（10ml清洗液加入190ml的純凈水中進(jìn)行稀釋。）

5）底物的準(zhǔn)備：使用前，將底物A和底物B按1:1混合。為了得到更好的檢測(cè)結(jié)果，在使用前，底物溶液要達(dá)到20~25℃，或培養(yǎng)30分鐘。

7、操作步驟

1）準(zhǔn)備好用于樣品稀釋的酶標(biāo)板。在每個(gè)微孔中加入100ul的樣品稀釋液。

2）陰、陽(yáng)性對(duì)照液個(gè)2個(gè)孔，其余各孔為樣品孔。

加入10ul的陰性對(duì)照液于A1和B1孔

加入10ul的陽(yáng)性對(duì)照液于C1和D1孔

其余各孔加入10ul樣品

3）用封板膜把反應(yīng)孔蓋好，然后輕輕地振蕩酶標(biāo)板。此步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性是很重要的。

4）在37℃下，孵育60分鐘。

5）用已稀釋好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要將板里的水扣干凈。

6）每孔加入100ul酶標(biāo)物。

7）在37℃下，孵育30分鐘。

8）用已稀釋好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要將板里的水扣干凈。

9）每孔加入100ul底物。

10）18～25℃下，孵育15分鐘。

11）每孔加入100ul終止液終止反應(yīng)。

12）用酶標(biāo)儀，在450nm和620nm雙波長(zhǎng)的條件下，讀取吸光值。必須在30分鐘內(nèi)，完成讀取結(jié)果。讀取結(jié)果時(shí)，酶標(biāo)板內(nèi)不能出現(xiàn)氣泡。

8、檢測(cè)分析

1）檢測(cè)的有效性

①　陰性對(duì)照的平均OD值<0.200

②　陽(yáng)性對(duì)照的平均OD值>0.500

③　如果上述其中一個(gè)值超出了規(guī)定的范圍，則該實(shí)驗(yàn)被視為無(wú)效。所檢的樣品需要重新進(jìn)行檢測(cè)。

2）計(jì)算判斷值

①　用A1和B1孔的吸光值來(lái)計(jì)算陰性對(duì)照的平均OD值。

判斷值＝（0.35＋陰性對(duì)照的平均OD值）

②　根據(jù)陰性對(duì)照的OD值，樣品結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

-陽(yáng)性結(jié)果：樣品OD值>判斷值

-陰性結(jié)果：樣品OD值<判斷值

③　舉例：

陰性對(duì)照平均OD值：0.078

判斷值＝0.35＋0.078＝0.428

樣品OD值為0.389：樣品為陰性

樣品OD值為0.894：樣品為陽(yáng)性

9、局限性和干擾性

1）檢測(cè)步驟，注意事項(xiàng)和對(duì)結(jié)果的判定必須嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2）采樣：

①　樣品中所含有的*，對(duì)測(cè)試結(jié)果沒(méi)有影響。

②　巴氏滅菌法（60℃條件下不少于10小時(shí)）消毒過(guò)的樣品可能導(dǎo)致活性減弱，故而不可用于檢測(cè)。

③　加熱滅活的樣品（56℃，30分鐘）并不影響試驗(yàn)結(jié)果。

④　抗凝血?jiǎng)?/span>如肝素，EDTA，檸檬酸鹽不會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

⑤　溶血的樣品應(yīng)在使用前離心，以免被細(xì)胞內(nèi)成分干擾。

⑥　含有脂肪酶或黃疸的樣品并不影響檢測(cè)結(jié)果。

3）操作規(guī)程中樣品加入失敗，將會(huì)引起錯(cuò)誤的結(jié)果，如有研究上有任何疑似PRRS病毒感染癥狀，建議重復(fù)檢驗(yàn)。

10、保存條件

所有試劑都要保存在2～8℃的環(huán)境中。

11、穩(wěn)定性

1）不要使用過(guò)期的試劑盒

2）準(zhǔn)備的試劑的穩(wěn)定性