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化學發光法生物素標記核酸檢測試劑盒

化學發光法生物素檢測試劑盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一種通過Streptavidin-HRP及后續的BeyoECL Moon試劑來實現化學發光檢測Biotin標記核酸的檢測試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等實驗中，采用生物素標記的DNA或RNA探針時的檢測。本試劑盒不適用于生物素標記蛋白的檢測。
      本試劑盒同時還提供了封閉液、洗滌液等檢測時所需的配套試劑。
      本試劑盒采用了高質量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯的比例大于3，這樣比采用
Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進行檢測要更方便，并且靈敏度更高。
      采用了非特異性結合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結果背景更低靈敏度更高。
      本試劑盒沒有提供生物素探針標記相關的試劑，生物素標記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應地使用本公司提供的的生物素3'末端DNA標記試劑盒或EMSA探針生物素標記試劑盒。
      本試劑盒可以用于檢測至少10塊10 x 10cm有生物素標記EMSA探針的膜，即共1000cm²。

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包裝清單：

使用說明：

1. 在使用Biotin標記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續洗滌后，或RPA的轉膜和交聯后，或EMSA的轉膜和交聯后，可以使用本試劑盒開始檢測。下面的檢測過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。

2. 37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。

注意：封閉液和洗滌液必須*溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50℃之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產生，在冬天需特別注意。

3. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。

4. 取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。

5. 去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。

6. 取25ml 洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q級純水，混勻配制成125ml洗滌液。

7. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鐘。

8. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。

9. 重復步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間均約為5分鐘。

10. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。

11. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混勻，配制成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必須現配現用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。

12. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。

13. 在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液*覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。

14. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內。

15. 用X光片壓片1-5分鐘?？梢韵葔浩?分鐘，立即顯影定影，然后根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結果。

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常見問題：

1. 背景較高。

可能是由于封閉液或洗滌液中出現沉淀或混濁。解決方法是參考使用說明，加熱封閉液和洗滌液使封閉液和洗滌液*溶解。

2. 出現斑點狀背景。

可能是由于過長時間存放導致Streptavidin-HRP Conjugate中出現沉淀，解決方法是12000-14000g離心1分鐘再吸取近液面的Streptavidin-HRP Conjugate。轉膜時有氣泡也會導致斑點狀背景產生，解決方法是轉膜時膠、膜、濾紙之間確保沒有氣泡。

3. 沒有條帶或信號很弱。

A. 探針標記效率太低，解決方法是檢測探針標記效率，確保探針的標記效率較高。

B. 探針用量不足或樣品量不足，解決方法是加大探針用量或加大樣品用量。

C. 樣品中待檢測的核酸降解，解決方法是檢測待檢測的核酸樣品是否出現降解，如降解則須制備新的樣品。

D. 轉膜效果不佳，解決方法是檢查轉膜的方法和步驟，使用預染的標準品作為轉膜的對照。

E. 選擇了不適當的膜，盡管不少情況下硝酸纖維素膜也可以完成檢測，請優先選擇帶正電荷的尼龍膜。

F. 檢測過程中膜干掉了，解決方法是確保檢測過程中膜可以被液體覆蓋或始終保持濕潤。

G. 沒有交聯或交聯效果不佳，解決方法是進行適當的交聯，如果交聯效果不佳則須檢測交聯的效率。

H. 洗滌液(5X)沒有稀釋就直接使用，請把洗滌液(5X)稀釋至1X后再使用。

I. X光片曝光時間不足，解決方法是適當延長曝光時間。

保存條件：
      3308-3 Streptavidin-HRP Conjugate在-20℃保存，其余可4℃保存。如果長期不用，整個試劑盒可-20℃保存，-20℃可以保存更長時間。
      本產品于專業人員的科學研究用，不得用于研究診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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